巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌蛋白激酶基因突变体△CCK1的互补载体构建及转化

为了明确蛋白激酶CCK1在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能,在前期研究基础上通过PCR扩增,获得了该基因1604 bp的5′端片段（L－C5）和131 bp的3′端片段（L－C3）,同时以pCAMBIA3300质粒为模板扩增获得了552 bp抗性标记基因（L－Bar）,并用In－FusionHD Cloning Kit将L－Bar基因反向插入了L－C5和L－C3序列之间,克隆至pUC19载体上,成功构建了△CCK1突变体的互补载体p△CCK1－C。再从该载体上扩增互补片段,借助PEG介导法转化△CCK1突变体的原生质体,经Basta平板筛选、PCR检测和测序鉴定表明,获得了△CCK1突变体的互补转化子。为进一步明确CCK1基因在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌中的致病相关功能打下了材料基础。     

转座子诱变甘蓝黑腐病同黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｇｕｓＡ５上的抗性基因，通过“鸟抢法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６，Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序死的ＤＮＡ片段，并利用含有这些片段重组质粒，通过标记置换构字突变体。     

玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库的构建

构建玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01突变体文库,以期获得丢失玉米赤霉烯酮降解功能的突变子,克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因,阐明MQ01降解玉米赤霉烯酮的分子机制。将携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA电转化至玉米赤霉烯酮降解菌Bacillus amyloliquefaciens MQ01中,50℃高温条件下,把穿梭载体pMarA上转座子TnYLB-1随机插入到菌株MQ01基因组中,获得转座子插入突变的阳性克隆,构建MQ01菌株的突变体文库,随机挑选突变子采用PCR和Southern杂交方法进行验证。本研究成功获得了3 000多个TnYLB-1转座子插入突变的阳性克隆,构建了B.amyloliquefaciens MQ01的突变子文库,结果显示TnYLB-1转座子以单拷贝的形式随机插入到B.amyloliquefaciens MQ01的基因组DNA中,从而可以从转座子突变文库中筛选丢失玉米赤霉烯酮降解功能的转座突变子,从菌株MQ01中克隆玉米赤霉烯酮降解酶基因。     

盾壳霉对罗平旱地油菜菌核病防治效果研究

[目的]探索盾壳霉防治旱地油菜菌核病的效果及稳定性,为大面积推广提供科学依据。[方法] 采用对比法设计,使用9个油菜品种为试验品种,通过油菜出苗后伴细土撒施盾壳霉,调查每个品种施用盾壳霉和对照的发病株数和病级,计算发病率,病情指数和防效。油菜成熟后评价菌核病的产量损失比较。[结果]在罗平旱地油菜生产条件下使用盾壳霉粉剂,于油菜出苗后田间撒施防治菌核病,对成熟期菌核病发病株率无明显影响,但病情指数下降明显,品种间菌核病综合防治效果为1.41%-30.47%,平均防治效果14.7%。产量分析表明,盾壳霉使用对油菜千粒重提高具有积极的作用。     

食用菌木霉的生防细菌鉴定及相关基因功能预测

采用抑菌圈法筛选出12株对绿色木霉有明显抑制作用的生防细菌,其中抑菌效果较好的为12C2-4和MS82菌株。通过对峙培养法发现MS82菌株对双孢蘑菇菌丝生长几乎没有影响。通过API20 NE、API50 CH生理生化指标测定及基于16S r DNA基因片段的系统进化分析对MS82菌株进行分类鉴定,结果显示MS82属于假单胞菌(Pseudomonas sp.)。为了明确MS82中参与抗真菌活性相关的基因,利用Tn5转座子随机插入的方式构建MS82菌株的突变体库,获得完全失去绿色木霉抗性的突变体MS82MT31。通过对抗菌失活突变体中突变基因定位,发现突变基因为rpo B基因,与已知菌株Pf0-1的rpo B基因相似性为96%,说明rpo B基因与MS82抑菌活性物质合成密切相关。     

水稻叶片融合基因LF1的图位克隆及功能分析

[目的]克隆并解析水稻叶片融合基因LF1(Leaf Fusion 1)的功能,为阐明水稻叶片发育的分子机制奠定基础.[方法]lf1为水稻品种'02428'组织培养获得的叶片融合突变体.利用水稻叶片融合突变体lf1与籼稻品种'N22'构建遗传分离群体,精细定位lf1;结合突变体重测序分析确定候选基因,经基因敲除克隆LF1...     

水稻条斑病细菌dsp基因的克隆

用硫酸二乙酯(DES)化学诱变水稻条斑病细菌RS105菌株，获得一株dsp基因突变体AM11。该突变体的菌落形态、颜色、胞外多糖产生能力以及胞外酶(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和纤维素酶)的活性与野生型菌株RS105无明显差异。将水稻条斑病细菌RS105基因库1200个克隆逐个导入dsp基因突变体AM11中，致病性测定结果表明，dsp基因阳性克隆pC101可以恢复AM11在水稻上的致病性。酶切分析显示，克隆pC101携44．92kb的dsp基因片段。亚克隆和功能互补结果显示，克隆pE46和pE47均具有恢复dsp突变体AM11致病性的能力，这表明决定水稻条斑病细菌dsp表型的基因位点至少有2个。     

盾壳霉对核盘菌的重寄生机制研究

室内对峙培养和寄生致腐作用测定结果表明 :盾壳霉 (ConiothyriumminitansCampbell)对核盘菌菌丝生长没有明显拮抗作用 ,但对菌核形成有一定抑制作用。被盾壳霉寄生的菌核表面皱缩、软化腐烂 ,后期菌核表面密生大量盾壳霉分生孢子器 ,并从顶端孔口分泌出黑色球状分生孢子黏液。显微镜检盾壳霉寄生的腐烂菌核石蜡切片 ,结果表明 :盾壳霉菌可在菌核的表面和内部疏丝组织寄生 ,并形成分生孢子器。盾壳霉分生孢子器表生、半埋生或埋生于腐烂菌核上。被盾壳霉寄生的菌核 ,后期拟薄壁组织消解断裂成不连续的残片 ,内部疏丝组织消解 ,在发病后期致密的疏丝组织被盾壳霉菌消解成的网状结构所代替。     

甜瓜T-DNA插入突变体的构建

[目的]构建激活标签载体并将其转入甜瓜中,获得甜瓜T-DNA插入突变体,为甜瓜功能基因组学的研究奠定基础.[方法]用PCR法扩增目的DNA片段,经EcoRI和SacI顺序酶切,将目的片段连接到pCAMBIA2301载体上,构建含4 ×35s Enhancer DNA片段的激活标签载体.以甜瓜品种‘伽师’为材料,利用农杆菌介导的转化体系转化甜瓜愈伤组织,获得甜瓜T-DNA插入突变体.[结果]获得4株T0代甜瓜转化幼苗,通过Kan筛选和PCR鉴定甜瓜转化幼苗的DNA中是否含有目的基因,证明其中3株甜瓜转化幼苗为转基因植株.[结论]获得了突变植株,为甜瓜重要性状基因发掘奠定基础.     

华山松疱锈病的重寄生真菌(深绿木霉)中几丁质酶基因cDNA片段的克隆

[目的]分离深绿木霉S5003中的几丁质酶基因,为获得高抗病的转基因植株奠定基础。[方法]采用华山松疱锈病的锈孢子壁作为诱导物,诱导深绿木霉SS003中几丁质酶基因的表达,并通过lit—PER方法扩增得到几丁质酶基因片段。[结果]锈孢子壁可诱导出高活性（40．17μg／10min）的几丁质酶,PCR扩增得到了长度为834bp的特异片段,经序列测定及分析显示该片段为几丁质酶基因片段。[结论]深绿木霉SS003的几丁质酶基因片段的获得,为分离全长基因以及进一步利用该基因生产几丁质酶以及进行基因转化提供了可能。     

杀菌剂对盾壳霉和核盘菌的毒力及选择性研究

为了选择可与盾壳霉相结合共同防治菌核病的有效化学药剂,采用菌落直径法比较了9种常用杀菌剂对盾壳霉和核盘菌的毒力差异。结果表明,盾壳霉对多菌灵、菌核净、腐霉利和百菌清高度敏感,平均EC50为0.11~3.04 mg.kg-1;对异菌脲、乙烯菌核利和乙霉威中度敏感,平均EC50为11.83~14.17 mg.kg-1;对代森锰锌和福美双敏感性最低,平均EC50为49.88~53.39 mg.kg-1。核盘菌对多菌灵、菌核净、乙烯菌核利、福美双和腐霉利高度敏感,平均EC50为0.08~2.07 mg.kg-1;对乙霉威、异菌脲和百菌清中度敏感,平均EC50为6.66~15.33mg.kg-1;而对代森锰锌最不敏感,平均EC50为33.57 mg.kg-1。福美双和乙烯菌核利对盾壳霉和核盘菌的选择性指数较大,分别为32.28和12.71,比较适合与盾壳霉搭配共同控制菌核病。     

关于生防菌盾壳霉的研究

许多研究表明盾壳霉具有控制温室和田间多种作物菌核病的潜力.为了加速盾壳霉产业化进程和更好地发挥其控制菌核病的作用,以及为了使人们对盾壳霉的研究不断深入,综述了盾壳霉生态学特性,对核盘菌的生防机制及在菌核病防治上的潜力等方面的研究进展.     

水稻果胶甲基转移酶OsTSD2基因突变体的分析

探讨水稻果胶甲基转移酶OsTSD2基因的功能,尤其是对生长发育的影响,筛选并鉴定了OsTSD2基因突变的3个突变体tsd2a、tsd2b和tsd2c。表型观察显示:突变体水稻结实率下降、种子粒长变短、粒宽变窄、千粒重下降;突变体的颖壳颜色变暗,颖壳的破裂程度加重并出现新的背部破裂;荧光免疫标记试验研究发现,突变体种子萌发率下降可能是由于突变体种子盾片中的甲基化果胶含量低所致。结果表明,OsTSD2基因的下调导致水稻的种子在发育和萌发过程中存在明显的缺陷。     

重寄生真菌盾壳霉与核盘菌对峙培养的差异代谢物分析

运用基于液相质谱联用技术的代谢组分析手段,检测重寄生真菌盾壳霉和宿主植物病原菌核盘菌对峙培养时的代谢物差异。结果发现:盾壳霉与核盘菌对峙接触能显著诱发盾壳霉代谢物的分泌,构建盾壳霉特定代谢物数据库检测到3种代谢物涉及重寄生过程,分别为Macrosphelide A,Benzenediol和5-Aminopentanoate,且对峙接触2d时检测到的代谢物积累量最大。对盾壳霉重寄生过程代谢物变化的分析结果表明,真菌重寄生能诱发代谢物水平的交流和次级代谢物积累。     

银杏漆酶同源基因片段的克隆与分析

[目的]克隆银杏漆酶同源基因,为今后深入研究漆酶在银杏体内的功能提供基础。[方法]在提取银杏雄株叶片基因组DNA的基础上,利用PCR的方法克隆银杏漆酶同源基因片段。[结果]获得了一段基因序列,经对该基因片段的核苷酸序列分析表明,它与桃漆酶同源基因在结构上高度保守,相似性高达68％。[结论]成功克隆了银杏漆酶同源基因的部分序列。     

菌核寄生菌盾壳霉的研究：Ⅰ.生物学特性及在湖北省的自然…

采用菌核诱捕法从源于湖北省４０个县市的土壤样品中分离及鉴定同腐烂菌核相关的真菌。结果表明：重要的菌核寄生菌盾壳霉在湖北省分布于西北及西南部高海拔山区，表现出明显的地域性。除核盘菌，质壳霉还可寄生三叶草核盘菌和小核盘菌。盾壳霉菌丝生长和分生孢子萌发的适温为２０℃，菌丝生长的最适ｐＨ值为４，光对孢子的产生具明显的促进作用。此外，分生孢子萌发需９５％以上的空气相对湿度。     

农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究

构建了ura3缺失基因载体pEMT-△ura3,采用农杆菌介导法转化里氏木霉QM9414,在含尿嘧啶核苷(1.87 mg.mL-1)和五氟乳氰酸(5-FOA,5 mg.mL-1)的筛选培养基上筛选转化子,经表型验证和PCR检测,获得ura3基因缺失突变体1株,ura3基因的同源重组率为16.6%。采用农杆菌介导法将黑曲霉的pyrA基因导入ura3基因缺失突变体中,使其回复野生型表型,从而建立了以pyrA基因作为筛选标记的里氏木霉受体菌株。     

盾壳霉寄生核盘菌过程中葡聚糖酶、几丁质酶及电导率的变化

为了解盾壳霉寄生核盘菌的生化机理,采用了紫外分光光度法测定了盾壳霉寄生菌核过程中,葡聚糖酶和几丁质酶的变化,并用电导率仪测定了这个过程中电导率的变化。结果表明:从被盾壳霉寄生的活菌核检测到(处理)葡聚糖酶和几丁质酶活性明显高于活菌核和被盾壳霉寄生的死菌核,其中处理的葡聚糖酶活性从15 d以后就明显高于菌核自身也高于盾壳霉本身的酶活性,处理的几丁质酶活性从10 d起就维持在较高水平,处理的电导率从10 d以后明显高于活菌核。在这个过程中这两种酶活性提高,电导率增大,膜透性增强。     

甘蓝黑腐病菌XC_3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC_3374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC_3374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789 bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367 bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332 bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC_3374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明, XC_3374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374 病斑平均长度分别为13.000和11.983 mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC_3374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。