水稻白叶枯病植株内生细菌的分离及其拮抗功能

从云南省感染水稻白叶枯病的病株和健康植株上共分离得到475株植株内生细菌,从中筛选出167株对水稻白叶枯病病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,简称Xoo)有拮抗作用的内生细菌。病株体内拮抗内生细菌的菌株数量多于健康植株,病株和健康植株根、茎、叶中的内生细菌菌株数量略有不同,从病株根、茎、叶中分离出的拮抗内生细菌对水稻白叶枯病病菌的抑制作用差异不显著;而从健康植株的茎部和叶部分离出的拮抗菌对水稻白叶枯病病菌的抑制作用显著高于根部拮抗菌(P0.05)。采用对峙培养方法测定并比较分离菌株的抑菌能力,得到30株对白叶枯病菌抑菌能力较强的菌株,并对其进行5种病菌的抑菌谱测定。结果显示,30株菌株对5种水稻病害的病原菌均有抑制作用。通过16S rDNA序列分析发现,水稻内生拮抗细菌分别与GenBank序列数据库中17个属的细菌相似性较高,其中,农杆菌属(Agrobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、克雷伯菌属(Klebsiella)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)和葡萄球菌属(Staphylococcus)为发病植株特有的拮抗细菌属,而节杆菌属(Arthrobacter)和考克斯菌属(Kocuria)仅存在于对照植株中。     

北京地区杏树冰核活性细菌种类及其消长动态规律的研究

 【目的】弄清冰核活性细菌（INA细菌）在杏树上分布种类及分布与年消长动态规律，对于通过防治INA细菌防御杏树晚霜冻害具有重要的意义。【方法】对北京杏主产区27个杏栽培品种及山杏进行调查，采用形态及生理生化方法进行种类鉴定，采用小液滴冻结法测定冰核活性。【结果】共分离到22株-5℃有活性INA细菌菌株，被确定为2个属中的3个种： 假单胞菌丁香致病变种（Pseudomonas syringae pv.syringae）10株，占45.5%；成团泛生菌（Pantoea agglomerans）9株，占40.9%；凤梨泛生菌噬夏孢子致病变种（Pantoea ananas pv.uredovora）3株，占13.6%。成团泛生菌为杏树上首次发现的INA细菌，‘玉巴达’杏树上的INA细菌（P. agglomerans）数量分布存在3个高峰期：花期（3月末至4月初）、果实发育期（5至6月初）、越冬初期（12月），夏秋季及寒冬难以分离到INA细菌。【结论】INA细菌分布数量与杏树所处地理位置及生态条件有关，杏不同器官上分离到的INA细菌的频率也存在差异。     

草甘膦抗性菌株的分离鉴定及其抗性基因的克隆

从草甘膦污染土壤中分离获得一株耐受400 mmol/L草甘膦的菌株S1536,该菌株在草甘膦浓度为100～400 mmol/L之间生长迅速,最适pH为6.0,最适生长温度为30℃,具有氨苄青霉素抗性。以S1536基因组DNA为模板,通过通用引物进行扩增、测序获得其16S rDNA序列,在GenBank登录号为MG519831,在NCBI中经BLAST比对与泛菌属（Pantoea sp.）同源性达到99%。用ClustalW对S1536与泛菌属各个种模式菌的 16S rDNA进行多重序列对比,该菌株与Pantoea rodasii同源性最为接近,达到99.2%,故将菌株S1536命名为Pantoea rodasii S1536。该菌株具有较高草甘膦抗性,对温度和pH适应性强,是优良的耐草甘膦菌株,通过全基因组测序及基因注释,获得抗除草剂基因aroA序列,为下一步明确基因功能,挖掘Pantoea rodasii S1536高抗草甘膦的分子机制奠定基础。     

新疆棉花根际土壤铁载体产生菌的遗传多样性及系统发育研究

 【目的】了解中国新疆地区铁载体产生菌的遗传多样性和系统发育,为筛选高效铁载体产生菌提供依据。【方法】采用BOXAIR-PCR、16S rRNA PCR-RFLP和16S rDNA全序列分析方法对分离自新疆地区棉花根际土壤的铁载体产生菌的遗传多样性进行分析。【结果】在BOXAIR-PCR分析中,68株供试菌分为11个遗传群;在16S rRNA PCR-RFLP分析中,68株供试菌分10个遗传群;代表菌株的16S rDNA 全序列分析表明,供试菌分属于假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动细菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、短状杆菌属（Brachybacterium）和泛菌属（Pantoea）。其中,假单胞菌属（Pseudomonas）为优势属。【结论】分离自新疆地区棉花根际土壤铁载体菌存在极大的遗传多样性。     

拮抗根癌土壤杆菌的桃内生细菌的筛选鉴定

【目的】从对根癌病具有获得抗性(SAR)的桃单株"西北13-1"的枝条内分离鉴定内生细菌,分析其种群组成并从中筛选拮抗根癌土壤杆菌的高效生防菌,为桃根癌病的生物防治探索新方向并提供新的生防菌资源。【方法】首先,将根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种到"西北13-1"的桃树枝条上,并以无菌水接种作为对照;然后,分别于接种前、接种后10 d和接种后60 d采集接种处理和对照处理的"西北13-1"枝条。表面消毒桃树枝条样品后采用涂布平板法分离内生细菌;并结合16S r DNA序列鉴定,比对初步鉴定菌株,分析内生细菌的数量及组成差异。采用平板拮抗法、温室防病效果测定筛选拮抗根癌土壤杆菌的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定,明确其分类地位。为揭示拮抗菌可能具有的其他拮抗作用机制,通过电击转化将含有GFP基因的p BBR1MCS-2质粒导入拮抗菌株中,然后进行GFP标记菌株对根癌土壤杆菌的抑菌试验、生长动力学分析、稳定性测试。采用灌根法提前接种标记菌株菌悬液,第2天接种根癌土壤杆菌菌悬液,应用激光扫描共聚焦显微镜和平板稀释法研究标记菌株在番茄根部的定殖情况。【结果】从"西北13-1"桃枝条中共分离到108株内生细菌,基于16S r DNA序列,这些菌株分别属于伽马变形菌类(Gammaproteobacteria)、阿尔法变形菌类(Alpharoteobacteria)、放线菌类(Actinobacteria)、厚壁菌类(Firmicutes)、拟杆菌(Bacteroidetes),共计5个细菌类群17个属,显示了桃树枝条中内生细菌丰富的种群多样性。其中,伽马变形菌类的肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)和根瘤菌属(Rhizobium)最多,其数量在接种根癌土壤杆菌后显著上升,包含了14株产抑菌圈的拮抗菌中的10株细菌。经鉴定,筛选出的两株抑菌活性较高、具有生防潜力的拮抗菌10DM4-1和10DI2-2分别为泛菌(Pantoea deleyi)和肠杆菌(Enterobacter cowanii),它们可显著抑制向日葵根癌瘤的形成,防治效果分别为86.08%和89.87%。标记菌株10DM4-1-gfp和10DI2-2-gfp灌根番茄后,可在根部细胞间隙观察到目标菌落,标记菌株的数量在0—10 d时呈现急剧下降趋势,最后保持相对稳定的较低水平(104CFU/g),说明了它们在番茄根组织内具有良好的生存和定殖能力。【结论】桃"西北13-1"的内生菌中存在着能够拮抗根癌土壤杆菌的细菌,这些具有拮抗活性的菌株与桃"西北13-1"具有根癌病抗性有关。分离得到的泛菌10DM4-1和肠杆菌10DI2-2可能通过产拮抗物质、占据根部有利生态位拮抗根癌土壤杆菌。     

水稻胡麻斑病土壤拮抗菌的筛选·鉴定及抑菌谱分析

[目的]从土壤中筛选对水稻胡麻斑病病原菌(Helminthospotium oryzae Breda de Hann)具有稳定拮抗作用的细菌。[方法]利用稀释平板法对从土样中分离出的细菌进行拮抗菌的初筛,再采用室内平板筛选法进行复筛。将拮抗效果最佳的菌株进行培养,通过菌体形态特征观察和生理生化测试进行菌种鉴定,并采用平板对峙法进行拮抗菌的抑菌谱分析。[结果]从38份土样中分离了494株细菌,初筛获得拮抗菌株24株,复筛得到4株拮抗能力较强的菌株,经鉴定4种拮抗菌均为地衣芽孢杆菌属(Bacillus licheniformis),并得到其抑菌谱。[结论]为利用拮抗菌生物防治水稻胡麻斑病提供了理论依据。     

桑树内生细菌多样性及内生拮抗活性菌群的研究

为探究桑树内生细菌多样性,获得拮抗性内生菌,开发利用桑树内生菌资源,通过非培养法构建16S rDNA文库,并结合组织分离培养法对桐乡青(桑树品种)内生细菌的种群特征进行了研究.非培养法研究结果显示所构建文库的111个阳性克隆属于22个分类单元,其分属于3门10属,其中,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Massilia和甲基杆菌属(Methylobacterium)为优势菌属;使用不同培养基通过培养法从桐乡青茎中获得25个内生细菌分离株,基于16S rDNA序列系统发育分析其属于15个分类单元,其分属于3门12属,其中肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和泛菌属(Pantoea)为优势菌属.培养法得到的内生细菌种群与非培养法差异较大,仅假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为共同菌属,且培养法得到的内生细菌多样性和均匀度指数(H'2.54,D 0.91,J 0.79)均高于非培养法(H'2.21,D 0.84,J 0.48).采用抑菌圈法,以10株植物病原菌作为指示菌,结果显示多达18株桑树内生细菌对一种或多种病原菌有抑制作用.综上结果表明,桑树内生细菌具有丰富的多样性,并且包含大量具有抗菌活性的菌株,以桐乡青材料为例,抗菌活性菌株约占其内生细菌的72%.     

棉花黄萎病拮抗细菌7-30菌株的筛选与鉴定

[目的]筛选大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌,并对其进行生理生化鉴定。[方法]以棉花黄萎病痛原菌大丽轮枝菌（Verticillium dahliag）V-190为测试菌,筛选对其具有拮抗作用的芽孢细菌。通过初筛及复筛,得到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定。[结果]通过初筛从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株,再对其中拮抗能力较好的18株进行了复筛,得到抑菌圈达18．9mm的强抑菌活性的拮抗细菌7-30菌株,结合其形态特征和生理生化特征综合考察,初步判断其为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]获得了大丽轮枝菌的拮抗芽孢细菌7-30菌株。     

遵义市冰核细菌分离鉴定及拮抗细菌筛选

为了解遵义市霜冻植物上冰核细菌的种类以及筛选对冰核细菌有拮抗作用的细菌,采用小液滴冻结法鉴定冰核细菌的冰核活性,并用双层平板法筛选冰核细菌的拮抗细菌;采用形态学特征、生理生化鉴定以及16S rDNA序列对比分析等方法确定冰核细菌和拮抗细菌种类。结果显示,从遵义市采集到35种植物冻害标本,共分离到4株冰核细菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH;从遵义市采集到23种土样,共分离出3株拮抗细菌XH、XM、XL。经鉴定,Z-A、Z-B是菠萝泛菌(Pantoea ananatis),Z-C是成团泛菌(Pantoea agglomerans),Z-QCH是绿黄假单胞(Pseudomonas viridiflava)。拮抗细菌XH、XM是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),XL是甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。初步了解了遵义市冰核细菌的种类,为遵义市霜冻植物生物防治奠定了一定基础。     

甘蔗黑穗病拮抗细菌的促生长特性及其防治效果研究

【目的】筛选具有拮抗甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）及促进植物生长特性的细菌，为甘蔗黑穗病的生物防治提供菌株资源和参考依据。【方法】采集出现黑穗病甘蔗株的根际土壤，采用平板对峙培养法分离纯化获得拮抗菌株，通过16S rRNA序列分析明确拮抗菌株的分类地位并分析其促生长特性；采用桶栽试验，研究筛选获得的优良拮抗菌株对甘蔗黑穗病的防治效果。【结果】分离纯化获得68株细菌菌株，其中7株（G1、G10、G12、G14、G20、G21和G23）对甘蔗黑穗病菌具有抑制效果。7株菌株具有产纤维素酶、产几丁质酶、分泌吲哚乙酸（IAA）、产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACC脱氨酶）、嗜铁能力、溶解有机磷、产蛋白酶及产氢氰酸（HCN）等不同程度的促进植物生长特性，特别是3株伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）菌株G1、G10和G23的综合效果更好。用拮抗能力较强的菌株G1、G10、G12和G23防治甘蔗黑穗病的桶栽试验结果表明，4株拮抗菌株处理均可有效抑制黑穗病的发生，提高甘蔗的出苗率和生物量，其中以菌株G23处理的综合效果最好。【结论】分离获得7株对甘蔗黑穗病菌拮抗效果较好的菌株，均具有不同程度的促进植物生长特性，其中以菌株G23的综合效果最好，具有良好的应用前景。