酵母双杂交系统用于WSSV粘附蛋白VP37相关蛋白基因的研究

为研究WSSV的粘附蛋白VP37相关蛋白的基因，应用酵母双杂交系统Ⅲ筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。构建VP37基因的重组载体PGBKT7-VP37，把它转化酵母Y187后与含文库质粒的酵母AH109配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。经过PCR鉴定确定了1个阳性克隆。测定该段cDNA序列并进行生物信息学分析，结果显示，此cDNA片段编码的蛋白与蛋白酶的同源性较高，该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。成功筛选了VP37相关蛋白的cDNA片段，为研究WSSV入侵以及感染致病的机制等方面提供了新线索。     

鲤鱼和斑马鱼同义密码子使用偏性分析

本研究利用鲤鱼454测序所获得的基因的表达序列和GeneBank中斑马鱼全部基因的编码序列,采用多重变量分析软件CodonW对鲤鱼和斑马鱼影响密码子用法的因素进行了分析.结果表明,两个在59种同义密码子中有27种为最优密码子.伺时还指出,最优密码子的使用频率(Fop)与基因的G+C含量(GC),尤其是第三位密码子的G+C百分含量(GC3S)、密码子适应指数(CAI)和密码子偏爱指数(CBI)之间均呈现极显著的正相关(鲤鱼和斑马鱼的相关系数分别为r=0.4108和0.4087、0.5354和0.5628、0.7547和0.7771、0.9803和0.9741),而与有效等位基因数ENc存在显著负相关(相关系数r=-0.2832和-0.2390).表明基因GC含量直接影响密码子使用的偏性,同时基因的表达水平越高,对密码子的使用偏向性越强.     

WSSV-VP37小肽在大肠杆菌中的偏爱型表达

选用对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)囊膜蛋白VP37的功能区段,利用大肠杆菌密码子偏爱性,在氨基酸不变的情况下将VP37中的密码子通过人工合成改为大肠杆菌偏爱型密码子,并克隆至表达载体pBAD/gIIIA中,构成重组载体pBAD/gIIIA-VP37p′.将重组载体转化入大肠杆菌Top10中,在相同条件下用L-阿拉伯糖与未优化的重组菌株Top10-pBAD/gIIIA-VP37p一同诱导.结果显示,与野生型基因VP37p相比,经密码子优化的VP37p′基因表达目的蛋白量占总蛋白的40.5%,明显高于野生型6.5%的目的蛋白表达量.     

鲤和斑马鱼HOX基因家族同义密码子使用偏性的分析

运用CodonW程序计算和统计分析了鲤和斑马鱼HOX基因家族密码子组成、同义密码子使用频率。结果表明,鲤和斑马鱼HOX基因家族的最优密码子分别为6和9种。鲤和斑马鱼以A或u结尾的密码子发生强烈偏向;最优密码子的使用频率（Fop）与密码子适应指数（CAI）、密码子偏爱指数（CBI）、基因的G＋C含量（GC）,尤其是第三位密码子的G＋C百分含量（GC3S）之间呈极显著的正相关（鲤和斑马鱼的相关系数分别为r=-O．5946和0．7884、0．9772和0．9616、0．3356和0．5380、0．5424和0．8144）,而与有效等位基因数ENc存在显著负相关（相关系数r=-0．1241和0．3987）。实验表明：同义密码子第三位密码子碱基含量和组成直接影响着最优密码子使用偏性,基因的表达水平越高,对密码子的使用偏性越强。     

WSSV蛋白酶性质的研究

从感染白斑综合症病毒(Whitespotsyndromevirus,WSSV)的对虾中提取和纯化WSSV,对其蛋白酶活力进行分析。结果表明,WSSV蛋白酶具广泛的pH稳定性,当pH达7.5时,蛋白酶活性最大;pH高于10 0时,酶活力很低,其蛋白酶偏碱性。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活性有抑制作用。Ca2 、Mn2 、Fe2 和Cu2 可降低WSSV蛋白酶活性,但Mg2 有轻微的激活作用。胰蛋白酶抑制剂在浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性无影响。Leupeptin使蛋白酶活性降低12.29%。Chymostatin在质量浓度为12.5～25.0mg/L时,对WSSV蛋白酶活性有强烈的抑制作用,表明WSSV蛋白酶类属胰凝乳蛋白酶。蛋白质修饰剂对WSSV蛋白酶活性影响的研究结果表明,组氨酸残基为WSSV蛋白酶活性基团,而巯基为非必需基团,说明WSSV蛋白酶为非巯基依赖型的蛋白酶。     

3种DNA提取方法对WSSV检测结果的影响

比较了酚-氯仿法、煮沸法、试剂盒法3种基因组DNA提取方法对WSSV DNA提取效率、纯度及病毒检测结果的影响.结果表明,3种方法的DNA提取效率平均值分别为101.5、372.6、21.5 ng/μl;OD260/OD280范围分别是1.979～2.175(平均值为2.070)、1.699～1.932(平均值为1.796)、1.784～2.075(平均值为1.951);OIE巢式PCR阳性率分别为60%、50%、70%;TaqMan定量PCR检测的病毒阳性率均为100%,病毒拷贝含量分别为916.0～2.23×106、63.3～1.78×106、479.7～2.70×106Copies/μl DNA.     

中国明对虾抗菌肽基因应答WSSV侵染的表达及其SNP分析

通过白斑综合征病毒(WSSV)感染实验,利用实时定量PCR技术研究了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)应答病毒侵染后,已知的3种抗菌肽(对虾肽)在肝胰腺、肌肉、肠和鳃4种组织中的差异表达情况.结果显示,虽然3种抗菌肽表现出明显的组织表达特异性,即在不同组织中的表达趋势和表达丰富度存在明显的差异,但是就同一个组织而言,3种抗菌肽在1～120 h WSSV侵染区间内的表达趋势基本一致,在0 h(未侵染病毒)时,3种抗菌肽的表达量极低(为0);在6～24 h期间,检测到明显的表达量;48～120 h期间,3种抗菌肽的表达量总体呈现下降的趋势.这暗示3种抗菌肽在对虾机体内可能具有相似的生物学功能.在此基础上,本研究对各类型中国明对虾抗菌肽的SNP位点进行了筛选,进一步对不同SNP类型与抗WSSV或易感WSSV的关联程度进行了分析,结果显示3种抗菌肽基因的SNP位点很少,且在抗性和易感对虾群体内不存在明显的偏向分布.     

凡纳滨对虾网格重链蛋白与WSSV结构蛋白在体外的相互作用

根据凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)网格重链蛋白(CHC)的2个功能结构域Clathtin Propel Repeat(Lv CHC1)和Clathrin Heavy Chain Repeat Homology(Lv CHC2),分别设计2对特异性引物,扩增目的片段,并克隆至p BAD/gⅢA载体上,以E.coli Top10为宿主菌,在阿拉伯糖的诱导下获得Lv CHC1和Lv CHC2重组蛋白。以Co~(2+)亲和层析方法,获得纯化的Lv CHC1和Lv CHC2蛋白,并经质谱分析验证。采用Far-Western方法分析Lv CHC1和Lv CHC2蛋白与白斑综合征病毒(WSSV)结构蛋白VP26、VP28N和VP37的作用,结果显示,Lv CHC1和Lv CHC2与VP28N没有结合作用,但都能与VP26和VP37结合,其中与VP26的结合作用较强。表明网格蛋白介导的内吞途径在WSSV侵染过程中起到了一定的作用。本研究可为深入研究WSSV入侵机制提供依据。     

WSSV具蛋白酶活性肽段的检测

在已有对虾白斑综合症病毒(WSSV)蛋白酶活性研究的基础上,从分子水平上确定WSSV呈蛋白酶活性的肽段。采用凝胶电泳技术的蛋白酶酶谱分析法确定WSSV蛋白酶活性,研究非变性条件下WSSV多肽裂解的条件,确定低温(20℃)裂解WSSV多肽可满足实验的要求。同时使用SDS-PAGE分离胶切割法结合蛋白洗脱分离出Vp19、Vp22、Vp24、Vp26和Vp28共计5个肽段,并对分离的5个组分进行蛋白酶活性的检测,初步结果表明,Vp19具有蛋白酶催化活性。     

白斑综合征病毒(WSSV)3种PCR检测方法的灵敏度比较

为了探讨不同PCR检测方法的灵敏度,分别利用TaqMan实时定量PCR、世界动物卫生组织(OIE)公布的巢式PCR引物(简称OIE)、黄海水产研究所种质资源与工程育种研究室(GB)设计的引物(简称GB)及2种巢式PCR对应的一步法PCR,对具有不同白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)含量的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)样品进行检测.结果显示,当使用已知病毒含量的标准品进行检测时,TaqMan实时定量PCR方法可以检测到l0个WSSV拷贝;OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法分别可检测到104和103个WSSV拷贝;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增时,分别可检测到5×104和2.5×104个WSSV拷贝;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物进行一步法PCR扩增时,分别可检测到104和5×103个WSSV拷贝.使用上述PCR方法分别对44份未知WSSV含量的样品进行验证,定量PCR方法检测阳性率为84.09%,OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法检测的阳性率分别为18.18%和27.27%;单独使用OIE巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率均为15.91%;单独使用GB巢式PCR的外引物和内引物扩增检测的阳性率分别为18.18%和20.45%.根据以上结果,PCR方法检测WSSV的灵敏度由高到低依次为:定量PCR、巢式PCR、一步法PCR.     

对虾白斑综合征病毒(WSSV)高分子量结构蛋白的分离

采用蔗糖密度梯度离心从患病对虾组织中提取WSSV,应用SDS-PAGE对WSSV结构蛋白进行了分析。采用12％分离胶,将WSSV样品煮沸5min,应用SDS-PAGE分离了WSSV的中低分子量结构蛋白,并将该结果与其他学者已发表的结果进行了比较。首次通过延长样品煮沸时间,采用8％分离胶,应用SDS-PAGE分离到了WSSV100kD以上的13条高分子量结构蛋白,计算出了每条蛋白带的分子量及其在总蛋白中的百分含量。其中WSSV高分子量结构蛋白的分离丰富了WSSV的研究范围,对今后深入的研究工作具有重要意义。     

中国对虾抗病性状遗传标记筛选及遗传多样性分析

对人工选育的29个中国对虾半同胞家系进行人工感染WSSV后,选取存活时间最长和存活时间最短各29个个体,组成抗病群体和感病群体。用400个随机引物进行RAPD分析,得到与抗病正相关的特异性遗传标记5个,与抗病负相关的特异性遗传标记两个。15个随机引物在两个群体的扩增位点进行统计,共得到82个位点,其中多态位点34个,占41.46%,两个群体的多态位点比例分别为40.24%和37.8%。Shannon′s多样性指数估算两个群体的平均遗传多态度为0.2177,SLT群体的遗传多态度为0.2190略高于SST群体0.2163;群体内的遗传变异（HPOP/HSP）0.9645,可见96.45%的遗传变异来自于群体内,3.55%的变异来源于群体间。统计各座位的基因频率计算出两个群体的遗传分化指数为0.0294,表明两个群体并没有发生明显的遗传分化。     

不同饵料对中国对虾幼虾生长及感染WSSV存活率的影响

采用4种饵料投喂中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）幼虾，用投喂感染的方法人工感染WSSV。测定体长、体重以及各组的攻毒存活率，实验周期15d。ANOVA分析结果表明，投喂鲜活卤虫组体长、体重的增长明显优于其他各组，差异达极显著水平（P〈0．01）；投喂人工配合饵料实验组的体长、体重增长量最小；投喂鱼肉组体长增长慢于投喂蛤蜊肉组，而体重的增长快于投喂蛤蜊肉组，差异均不显著（P〉0．05）。投喂卤虫成体和投喂鱼肉两组的攻毒存活率最高，明显高于投喂配合饵料和蛤蜊肉两实验组，差异达极显著水平（P〈0．01）；投喂卤虫组和投喂鱼肉组之间存活率无显著差异（P〉0．05），投喂人工配合饵料组和蛤蜊肉组差异不显著（P〉0．05）。巢式PCR检测表明，人工感染前的中国对虾幼虾少数携带WSSV，人工感染后全部个体检测到病毒特征片段。     

1种可用于检测WSSV蛋白酶的微量酶活测定技术

以酪蛋白为底物 ,对常规蛋白酶检测方法进行改进并与偶氮酪蛋白法进行比较 ,建立适应病毒微量蛋白酶的快速检测方法。结果表明 ,改进的微量蛋白酶检测方法具有微量、快速、灵敏度高的特点 ,适于病毒微量蛋白酶的检测。蛋白酶的最低检出量可达ng级。     

重组WSSV囊膜蛋白VP281和VP31的抗菌功能初步分析

为了解白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)两种囊膜蛋白VP281和VP31的功能,本实验对二者进行了原核重组表达.利用一种组成型分泌原核表达质粒pBTA1为表达载体,构建了组成型分泌WSSV囊膜蛋白rVP281、rVP28以及rVP28与增强型绿色荧光蛋白rEGFP融合蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α,分别命名为DhpVP281、DhpVP28和DhpVP28-EGFP.3种重组菌在LB固体培养基上生长12 h的菌落直径分别为(164.84±28.44)、(560.47±46.04)和(548.21±58.54)μm,生长19 h的菌落直径分别为(436.31±47.56)、(1 136.90±110.88)和(1 083.33±109.83) μm,生长24 h的菌落直径分别为(594.19±57.17)、(1251.19±188.86)和(1 264.29±172.78) μm;显示在所有培养时间,DhpVP281的菌落均显著小于DhpVP28或DhpVP28-EGFP的菌落(P＜0.05),推测rVP281的表达可能抑制大肠杆菌的生长.以pBTA1为表达载体,未能成功构建组成型分泌rVP31的重组DH5α.为了解其原因,使用pET-30a(+)为表达载体,构建了表达rVP31包涵体的重组菌株BL21(DE3) pLysS.将rVP31蛋白纯化并复性后,采用牛津杯法,检测到rVP31蛋白对溶壁微球菌具有抗菌作用.在动物病毒中发现具有抗菌作用的囊膜蛋白,可以增加有关WSSV的病毒学方面的知识.     

中国对虾雄性生殖系统感染WSSV在其垂直传播中的作用

通过人工感染实验,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)雄性亲虾进行投喂感染。在确定其携带WSSV粒子后,将被WSSV感染的精荚人工移植到健康的雌虾纳精囊内。在无其他病源的情况下,促其产卵繁殖,统计各组子代的受精率、孵化率及无节幼体至溞状幼体的变态率贸?式PCR技术对亲虾及子代进行WSSV检测。结果表明,受WSSV感染的精荚能够把病毒传播给健康雌虾,雌虾能产出携带WSSV的卵子,培育出带毒幼体。各组子代的受精率、孵化率及变态率的统计结果表明,感染组和对照组在受精率上没有明显区别,受WSSV感染的精卵细胞可以正常结合。对照组受精卵的孵化率明显高于感染组,差异显著(P=0.045<0.05)。对照组无节幼体的变态率也高于感染组。说明WSSV的入侵对受精卵及幼体的发育有影响,WSSV感染导致部分受精卵及幼体不能正常发育或死亡。