江西省生猪腹泻疫病防控技术指导意见(试行)

<正>一、主要病原引起生猪腹泻的主要疫病有:猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪伪狂犬病、猪轮状病毒病等,从近年来采集的生猪腹泻病料检测与病原分离结果来看,目前已分离鉴定出的致病病原包括猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病毒、博卡病毒、致病性大肠杆菌等多种病原微生物。根据监测和流行病学调查结果显示,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒是造成当前我省生猪腹泻流行的主要病原。     

3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测

试验建立了用于检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与猪轮状病毒(PRV)的三重RT-PCR方法,以调查猪群中腹泻病毒感染情况.通过该方法对采自广东省规模化猪场的95份临床疑似病毒性腹泻病料进行了检测,结果表明,猪流行性性腹泻病毒阳性率为33.7%,猪传染性胃肠炎病毒阳性率为4.2%,猪轮状病毒阳性率为20%;猪流行性性腹泻病毒和猪轮状病毒混合感染率为8.4%,猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒混合感染率为2.1%.     

非典型性瘟病毒SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测猪非典型性瘟病毒(APPV)的方法,本实验建立了APPV SYBR Green Ⅱ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法特异性试验结果显示,除APPV外,猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒等常见猪病病原检测均为阴性,表明其特异性良好;该方法最低检测限为2.8×10~3拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验的组内、组间变异系数均小于1%。利用该方法对临床56份来自四川各地的临床病料样品进行检测,检出5份阳性样品,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。本研究建立的APPV荧光定量RT-PCR检测方法为APPV临床检出以及后期并发症的研究奠定了基础。     

基于便携式荧光定量PCR仪的猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒现场检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒一步法荧光RT-PCR鉴别检测方法。本研究参照Gen Bank中猪流行性腹泻病毒以及传染性胃肠炎病毒特异性基因序列,设计特异引物和Taq Man探针,通过优化反应条件,建立了检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒的一步法荧光RT-PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒灵敏度分别可达0.32 TCID_(50)/100μL和1.58 TCID_(50)/100μL,该法对猪轮状病毒(RV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的Taq Man一步法荧光定量RT-PCR检测方法可对猪流行性腹泻和传染性胃肠炎进行快速诊断,适合现场检测,为猪病毒性腹泻的诊断和防控奠定了基础。     

一例猪流行性腹泻病毒与葡萄球菌混合感染的病原学诊断

为查明贵州省毕节市某猪场仔猪持续腹泻、消瘦死亡的原因,对送检的2头典型发病仔猪进行临床症状和病理剖检观察,采集病料进行细菌分离培养、生化试验、PCR检测和药物敏感性试验,以及猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒RT-PCR核酸检测。结果:仔猪临床症状为精神萎靡,食欲减退,水样腹泻,呕吐,消瘦直至死亡;剖检可见腹股沟淋巴结出血,肠道充气肿胀;细菌分离鉴定为葡萄球菌,该分离菌对盐酸多西环素、硫酸安普霉素、泰乐菌素高度敏感,对磺胺间甲氧嘧啶钠、头孢拉定、替米考星、硫酸粘杆菌素耐药;猪流行性腹泻病毒核酸检测为阳性,猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒核酸检测为阴性。结论:该猪场的发病仔猪存在猪流行性腹泻病毒与葡萄球菌混合感染。建议使用高敏药物对葡萄球菌感染进行治疗,同时加强猪流行性腹泻疫苗的免疫。     

猪流行性腹泻病毒双抗夹心ELISA的建立

用猪流行性腹泻病毒（PEDV）免疫蛋鸡后提取抗猪流行性腹泻病毒的特异性卵黄抗体为捕获抗体,鼠抗猪流行性腹泻病毒多克隆抗体为检测抗体,建立了猪流行性腹泻病毒病原检测的双抗夹心ELISA,其最适包被抗体浓度为1:4000（12.35μg/mL）,鼠抗猪流行性腹泻病毒的多克隆抗体最佳浓度为1:6000（10.25μg/mL）,样品反应时间为30min,酶标抗体工作浓度为1:6000,并以OD450≥0.130作为阳性判断标准。该方法与猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪流感病毒、大肠杆菌K88、K99、987P、F41等病原无交叉反应。对经猪流行性腹泻病毒PCR检测的100份粪便样本进行检测表明,8份PCR检测阳性样本中6份为本法阳性;PCR阴性者本法全部阴性。实验结果表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可用于猪流行性腹泻病毒的快速检测。     

哺乳仔猪病毒性腹泻的流行趋势和防治

引起仔猪腹泻的常见病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV),三者均为RNA病毒[1].笔者多次采取腹泻哺乳仔猪小肠病料送浙江农林大学动物健康监测中心做病原检测,结果表明造成浙江省这几年产房哺乳仔猪严重腹泻的病原主要是流行性腹泻病毒(PEDV),其次是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).还有几次送检腹泻哺乳仔猪的同时挤该窝哺乳母猪奶水2 mL送检腹泻病原,发现多数所产哺乳猪发生腹泻的母猪奶水里面含有与腹泻乳猪一致的腹泻病原,说明导致乳猪腹泻的病原很可能是通过母猪奶水感染.本文对哺乳仔猪病毒性腹泻的流行趋势和防治提出以下观点.     

2008-2018年我国猪流行性腹泻病毒混合感染分析

为了解我国猪流行性腹泻病毒混合感染的地区分布情况、季节性特征和混合感染病原类型,基于中国知网、NCBI等数据库,对2008-2018年间我国猪流行性腹泻病毒混合感染病例进行统计.结果显示,全国18个省市地区统计样本数量共计6951份,其中猪流行性腹泻病毒阳性样本数3345(48.12%)份,混合感染阳性样本数1325(19.06%)份;我国中部地区猪流行性腹泻病毒混合感染率高于其他省市;冬季(12~2月)为猪流行性腹泻病毒混合感染多发季节;细菌和病毒是猪流行性腹泻病毒混合感染的主要病原,在与细菌的混合感染中,主要混合感染病原类型为大肠杆菌,在与病毒的混合感染中,可以与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪嵴病毒、猪Delta冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒进行混合感染,混合感染主要以二重混合感染(15.41%)为主,三重混合感染和四重混合感染分别占总样本数的3.25%和0.40%.本文归纳了近10年我国猪流行性腹泻病毒混合感染的基本特征,为了解猪流行性腹泻病毒混合感染及提高疫病综合防控水平提供了一定的参考.     

贵阳市某猪场病毒性腹泻的诊断与防控对策

贵阳市某猪场发生了一起不明原因的猪腹泻,经采集132份猪腹泻样本(粪便、胃和肠内容物),分别用猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(Po RV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)RTPCR实时荧光进行病毒核酸分析鉴定,结果猪流行性腹泻病毒阳性率22.7%(30/132)、猪轮状病毒阳性率2.3%(3/132)、猪传染性胃肠炎病毒阳性率9.8%(13/132)。确诊此次疫病系流行性腹泻病毒、轮状病毒、传染性胃肠炎病毒单独或混合感染所致。     

一例猪轮状病毒感染引发仔猪腹泻的诊断

为了查明贵州省黔西县某猪场仔猪持续腹泻、消瘦死亡的病因,试验采用RT-PCR法对送检样品进行猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒检测,并对RT-PCR产物进行测序分析。结果表明:送检仔猪腹泻为猪轮状病毒感染所引起,经序列分析发现该毒株属猪A群轮状病毒,并与G10血清型位于同一遗传进化分支。说明近年来在普遍发生的猪腹泻病例中,除猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒外,还存在猪轮状病毒感染的情况。     

Impact of porcine group A rotavirus co-infection on porcine epidemic diarrhea virus pathogenicity in piglets

Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) and porcine group A rotavirus (PGAR) are the main causative agents of acute diarrhea in piglets. In South Korea, PGAR is prevalent in piglets naturally infected with PEDV. Piglets naturally co-infected with PEDV and PGAR appeared to have severe and prolonged diarrhea that was distinct from that commonly observed. The aim of this study was to determine the impact of PGAR co-infection on PEDV pathogenicity in piglets. Thirty-six colostrum-deprived, one-day old, Large White-Duroc crossbred pigs were randomly divided into four equal groups: PEDV, PEDV/PGAR, PGAR, and control groups. The piglets were euthanized at 1, 2, or 3 days post-inoculation (DPI) to measure the villous height:crypt depth (VH:CD) ratio and to collect fecal samples for RT-PCR and virus isolation. No significant differences in mean VH:CD ratio and clinical symptoms (diarrhea, vomiting, dehydration, and anorexia) were observed between the PEDV/PGAR-infected and PEDV-infected groups of piglets at 1, 2 and 3 DPI; however, at 2 and 3 DPI, PGAR was detected in all fecal samples by RT-PCR and virus isolation. These findings failed to detect any interaction between PEDV and porcine rotavirus in the small intestines of piglets, suggesting that concurrent infection of PGAR may not synergistically enhance intestinal villous atrophy of piglets with PEDV disease. We propose that the severe diarrhea exhibited in PEDV and PGAR co-infected piglets may be more associated with the immunity level of the host rather than to any synergistic effect of PGAR on PEDV enteritis.     

猪流行性腹泻IgA、IgG抗体与PEDV抗原相关性研究

为了研究仔猪所吮乳汁中IgA抗体水平与乳汁中PEDV感染情况,探讨母猪免疫猪流行性腹泻疫苗后乳汁与血清中IgA、IgG抗体水平的相关性,临床采集多家规模化猪场母猪群乳汁、血清样品以及发病仔猪所吮母猪乳汁样品。采用实验室已经建立的IgA、IgG抗体ELISA方法,检测临床上猪流行性腹泻疫苗免疫后IgA抗体与IgG抗体的相关性,同时采用RT-PCR方法检测发病仔猪所吮乳汁中PEDV感染情况。结果表明,免疫猪流行性腹泻活疫苗后母猪乳汁中IgA抗体水平与血清中IgA、IgG抗体水平呈现很好的正相关性;当发病仔猪所吮母猪乳汁IgA抗体检测结果为阴性时,其PEDV抗原检测结果为阳性;乳汁IgA抗体检测结果趋于阳性样品临界值时,其PEDV抗原检测结果亦为阳性。结论:乳汁中低水平的IgA抗体很难有效地保护仔猪抵御PEDV感染;乳汁中IgA抗体与血清IgA、IgG抗体呈现很好的相关性,且乳汁中IgA抗体水平远远高于血清;通过IgG抗体水平可以间接反映乳汁中的IgA抗体水平,在初乳样品采集难度较大的情况下,可用于间接评估猪流行性腹泻免疫保护水平。     

猪流行性腹泻病毒分离鉴定及其灭活疫苗免疫保护效果研究

为筛选能用于猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗研发的流行毒株,收集PEDV阳性病料,以Vero细胞进行病毒分离试验,并对分离毒株进行外源病毒检测、病毒培养特性研究、仔猪毒力试验及免疫效力试验等。9份PEDV阳性病料共分离到3株病毒,分别命名为PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原体污染;PEDV-JS12株与PEDV-JX12株均能被PEDV特异性阳性血清中和;PEDV-JS12株能在Vero细胞上增殖并产生细胞病变,但适应细胞45代以后病毒培养效价仍然偏低;PEDV-JX12滴度能维持在106.0 TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力试验显示,该分离株能够通过人工感染复制出腹泻病例,并能从发病动物体内检测到感染的病毒。免疫攻毒保护试验显示,以PEDV-JX12株制备的灭活疫苗免疫母猪,对所产仔猪攻毒后免疫组6.25%(1/16)发病,对照组100%(8/8)发病。说明PEDV-JX12株能够适应细胞培养,免疫接种母猪能给仔猪提供有效保护,可以用于PEDV流行毒株的疫苗研发。     

猪腹泻相关肠道病毒分离研究进展

猪腹泻是全球养猪生产中最常见的疾病之一,病毒性腹泻具有传播快、致死率高和防控难的特点。常见的引起仔猪腹泻的病毒包括猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV),近几年新发现的猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪嵴病毒(PKV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)也与仔猪腹泻相关。病毒分离是病毒感染诊断的金标准,也是进行病毒研究的前提。对上述6种常见猪肠道病毒的分离进展进行综述,可为掌握这些病毒的分离情况、疾病发展动向监测、疫苗研发以及猪腹泻病的防控提供参考。     

猪流行性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据Gen Bank登录的猪流行性腹泻病毒（PEDV）毒株（登录号KJ960180）的M基因保守序列,设计1对扩增片段大小为299 bp的特异性引物,经PCR扩增、克隆、测序鉴定后,提取质粒作为阳性标准品,建立了PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。该方法在1.21×10^3~1.21×10^8拷贝/μL范围内呈现良好的线性,相关系数（R2）为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线为单个特异峰,产物Tm值为85.5~86℃,最低检测限为1.21×10^1拷贝/μL。本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、成本低且操作简单,适用于PEDV的早期诊断、定量研究和流行病学监测。     

猪流行性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立

为检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体水平,以纯化的PEDV作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV血清IgG抗体的诊断方法:当血清OD_(450nm)值0.31时,判定阳性;当OD_(450nm)值小于0.26时,判定阴性;当OD_(450nm)值介于两者之间判定可疑。结果表明,试验建立的ELISA抗体检测方法可用于检测猪血清中猪流行腹泻病毒抗体、监测猪流行腹泻病的流行情况和评价相关疫苗的免疫效果。     

Etiological Investigation of Diarrhea in Newborn Piglets and Molecular Characterization and Genetic Variation Analysis of ORF3 Gene of PEDV in North Guangdong

In order to understand the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, 31 diarrhea samples were collected from six pig farms in North Guangdong, the pathogen of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV) and porcine rotavirus (PoRV) were detected by Real-time RT-PCR, meanwhile, ORF3 gene of PEDV amplified from positive samples were sequenced and analyzed. Pathogen detection results showed that 83.87%(26/31) samples were positive for PEDV, all herds and samples were negative for TGEV and PoRV. The sequence analysis revealed that the ORF3 gene of 5 epidemic strains of PEDV were all 675 bp, homologies of nucleotides were 98.7% to 100.0%, and homologies with reference sequences of nucleotides were 94.5% to 100.0%, and some gene mutation in common nucleotides site. The results of gene phylogenetic trees showed that PEDV could be divided into two groups, PEDV genetic relationship between field strains in North Guangdong and some regions in China, Southeast Asia, North America, Europe from 2013 to 2015 was closer, classed as a gene subgroup, from 2011 to 2012 main epidemic strains in our country and vaccine strains classed as other two gene subgroups. These results indicated that PEDV infection was the main pathogen of newborn piglets diarrhea in North Guangdong region, as time passed, the PEDV epidemic strains gene presented a tendency of evolution and variation.     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。     

猪流行性腹泻病毒COE核酸疫苗的构建及免疫原性

用疑似患猪流行性腹泻病猪肠病料,扩增部分保护性抗原基因（COE基因）,通过T4连接酶将COE基因与真核表达载体plRES2-EGFP进行连接,提取纯化重组质粒。通过脂质体转染vero细胞,用SDS-PAGE和westernblot鉴定COE蛋白的表达。用重组质粒对BALB／c小鼠进行免疫,观察免疫效果。结果显示成功构建了pIRES2-EGFP—COE真核表达载体;目的蛋白在vero细胞中得到表达;重组质粒免疫小鼠能够产生相应抗体。结果表明,COE核酸疫苗可在小鼠体内诱导相应的抗体产生,这为进一步研究猪腹泻病毒的核酸疫苗奠定了基础。