茶树抗逆相关基因ERF的克隆与表达特性分析

对利用cDNA-AFLP技术所获得的茶树低温诱导差异表达片段TDF,通过RACE方法获得含完整编码区序列的茶树ERF基因cDNA克隆,其开放阅读框编码212个氨基酸,包含一个保守的结构域AP2/ERF,与多种植物ERF蛋白具有高度同源性。qRT-PCR分析表明,茶树ERF基因受低温、乙烯、脱水、NaCl等上调表达,最大表达量分别是诱导前的121.1、22.6、2.6和2.2倍。在不同组织器官中,茶树ERF基因在转录水平上存在显著差异,成熟叶片中表达最高,其次是芽,而根和茎中表达量较低且相当,花和种子中表达极低。推测该基因在茶树响应非生物胁迫中发挥重要作用以及在组织中的表达受到严格控制。     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

茶树丙氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析

丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,Ala AT)是与碳氮代谢相关的一种重要酶类。采用反转录PCR的方法克隆了茶树Cs Ala AT1的c DNA序列,该序列全长1 747 bp,包含一个完整的ORF(1 626 bp),编码541个氨基酸,推导的蛋白质分子量为59.4 k D,理论等电点(p I)为5.82。同源比对结果表明,Cs Ala AT1含有丙氨酸氨基转移酶亚家族保守的辅酶磷酸吡哆醛结合位点,其氨基酸序列与拟南芥At Ala AT1蛋白的相似性为84%。二级结构预测显示该蛋白由α-螺旋(40.67%)、无规则卷曲(29.57%)、β-折叠(13.68%)和延伸链(16.08%)组成,定位于线粒体,不含信号肽与跨膜结构。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现Cs Ala AT1在茶树各组织中均有表达,在根中的表达量最高;Cs Ala AT1基因表达对氮素的响应研究表明,成熟叶中Cs Ala AT1受氮素诱导上调表达,高浓度(1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素的诱导效应比低浓度(0.1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素诱导效应更强烈;在根中,处理24 h后,高氮诱导Cs Ala AT1上调表达,低氮诱导Cs Ala AT1下调表达。     

茶树CsPAL3基因cDNA全长克隆及其表达分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）由多基因家族编码,是花青素等多酚物质合成途径的起始酶,对其合成具有调控作用。本研究以紫化茶树武夷奇种C18茶树为材料,采用RACE技术克隆获得CsPAL基因cDNA,命名为CsPAL3（登录号为KY865305）,分析其生物信息学特征,并检测不同叶色茶树品种（系）中的花青素总量及茶树PAL家族成员基因的表达情况。结果表明,获得CsPAL3基因全长cDNA为2β518βbp,包含一个完整的2β130βbp开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码709个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定亲水性蛋白,预测分子量为77.40βkD,理论等电点为6.26;Blast分析序列发现CsPAL3与芒果的MiPAL相似性最高,为87%。而在同源进化树分析中与芍药的PiPAL亲缘关系较近。紫化茶树的花青素总量和CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因表达量均高于常规绿叶茶树和白化茶树。这表明茶树CsPALa、CsPALc、CsPAL3（CsPALe）基因上调表达可能促进茶树花青素合成积累,使得茶树叶片呈现紫色。     

茶树WRKY转录因子基因CsWRKY57的克隆及表达分析

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育及胁迫应答过程中均发挥重要的调控作用。为探究WRKY转录因子与茶树抗旱及耐盐性的关系,本研究基于茶树转录组数据库中的检索结果,以陕茶1号1年生茶树为试验材料,克隆获得了1个WRKY转录因子基因,命名为CsWRKY57。生物信息学分析表明,CsWRKY57基因cDNA全长为1 222 bp,编码303个氨基酸,预测分子量为33.5 kD,理论等电点为5.49;另外,蛋白比对分析显示,CsWRKY57包含1个典型的WRKY核心序列和1个C2H2型锌指结构,属于WRKYIIc家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsWRKY57基因在高盐、干旱、ABA胁迫下均被诱导表达,且表现出先增加后降低的趋势,表明CsWRKY57基因参与了茶树体内干旱、高盐和ABA的调控途径。转录激活活性试验表明,CsWRKY57无转录激活活性,意味着CsWRKY57可能需要与其他元件结合才能启动基因的表达。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

野生种花生钙依赖蛋白激酶基因家族的生物信息学分析

Ca2+是植物中重要的第二信使,几乎介导了植物生长发育的全部反应。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物中重要的钙传感蛋白,在植物生命活动中扮演着重要角色。目前2个二倍体野生种花生全基因组序列已经公布,而由2个野生种杂交后形成的异源四倍体栽培种花生的全基因组序列还没有公布,野生种花生CDPKs的生物信息学分析结果可以为栽培种花生CDPKs的研究提供参考。本研究采用生物信息学方法和工具对2个野生种花生CDPKs基因家族的全基因组分布、基因结构、进化和理化性质等进行分析。结果表明:2个野生种花生全基因组均比对到35个CDPKs基因序列,野生种花生与拟南芥CDPKs基因结构类似,蛋白质结构具有典型的蛋白质激酶和EF手型结构域,2个野生种花生与其它物种在进化过程中CDPKs变异较小,可能作为钙传感蛋白在细胞内各个部位和细胞器中行使功能。本研究结果可为栽培种花生的CDPKs结构和功能研究提供参考。     

普通小麦花发育基因 TriFVE 的克隆与染色体定位

植物自主开花途径花发育基因FVE对植物营养生长向生殖生长的转变起重要的调控作用。为了进一步研究该基因在小麦中的调控功能,利用小麦基因组数据和二穗短柄草基因组数据,通过RT-PCR和PCR技术对小麦花发育基因FVE的DNA序列和cDNA序列进行了克隆和序列分析,分别获得了7 034bp(TriFVE1,Gene Bank JQ317687)和6 910bp(TriFVE2,Gene Bank JQ317688)的两个FVE基因序列。基因结构分析表明,FVE基因由15个外显子和14个内含子组成,TriFVE1和TriFVE2基因的内含子序列存在大片段的插入/缺失,同源性仅为79.87%。TriFVE1和TriFVE2的cDNA编码区序列均为1 368bp,存在4个SNP位点,编码455个氨基酸的FVE蛋白序列完全一致。利用"中国春"和21个缺四体将TriFVE1和TriFVE2分别定位于小麦3A和3D染色体上。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了FVE基因在单棱期、二棱期和穗分化时期的小麦茎尖组织表达模式,发现二棱期和穗分化期TriFVE的转录水平显著高于单棱期,表明FVE在小麦花发育由营养生长到生殖生长过程中起重要作用。基于FVE蛋白序列的系统进化树分析表明,苔藓植物、单子叶和双子叶植物被明显分为不同类群,该基因随着物种的进化而进化,可以为研究植物分子进化关系提供参考。     

茶树DNA甲基转移酶基因CsDRM2的克隆及表达分析

DNA甲基化作为表观遗传修饰的主要途径之一,能够通过对基因组 DNA 的修饰参与植物对外界环境胁迫的响应, DNA甲基化需要DNA甲基转移酶的参与.实验室前期研究表明,茶树在冷驯化过程中发生了甲基化反应.通过RACE克隆,获得了茶树中DNA甲基转移酶CsDRM2基因的cDNA全长序列(NCBI登录号KR057963).CsDRM2序列全长2328bp,含1815bp的开放阅读框,编码604个氨基酸,预测蛋白质分子量为67.39 kD,理论等电点(PI)为4.85.生物信息学分析结果显示,茶树CsDRM2蛋白与芝麻和烟草的亲缘关系最近,CsDRM2的氨基酸序列与其他植物的DRM2相似性均高于65%.CsDRM2基因表达分析的结果发现,随着冷驯化的进行,CsDRM2基因的表达量呈现出增加的趋势,参与茶树冷驯化过程的甲基化响应.     

茶树类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶基因的克隆和表达分析

以茶树叶片为材料,结合同源克隆方法和RACE技术,克隆了1条UFGT基因,命名为CsUFGT。该基因cDNA全长为1526bp,ORF长1380bp,编码459个氨基酸,推测等电点5.96,推测分子量为49.486kDa。该基因编码的蛋白质与葡萄UFGT（P51094.2）的一致性为59%,相似性为75%,其C-端含有植物UGT家族成员特有PSPG基序。荧光实时定量PCR分析表明,该基因在茶树根茎叶中均表达,在第4叶表达量最高,根和茎中表达量较低。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

茶树花青素还原酶基因在大肠杆菌中的表达及优化

茶树花青素还原酶是催化非酯型儿茶素EC和EGC合成的关键酶。采用RT-PCR技术,获得了茶树花青素还原酶基因的开放阅读框,它编码含337个氨基酸的蛋白质,推测分子量为37kD,等电点为6.54;成功地将该基因重组到表达载体pET32a(+)上,并在大肠杆菌rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、氨苄青霉素浓度,纯化出目的蛋白。HPLC检测表明,目的蛋白具有ANR酶活性。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

茶树基因组DNA提纯与鉴定

采用在细胞核被裂解之前去除细胞质中的茶多酚和蛋白质，而后用ＳＤＳ裂解细胞核，异丙醇和乙醇沉淀基因组ＤＮＡ的方法，分别从不同茶树品种新梢、干梢及冰冻新梢中成功地提取和纯化基因组ＤＮＡ，并对其ＤＮＡ的得率和质量进行了鉴定。ＤＮＡ的得率在２０５～９６３ｎｇ／ｍｇ鲜重之间，所得到的ＤＮＡ样品片段均大于２１ｋｂ，适宜于进行限制性酶切和ＲＡＰＤ反应。实践证明，上述提取富含酚类物质植物基因组ＤＮＡ的方法，不仅迅速简单，而且经济有效。     

茶树花青素还原酶的酶学特性研究

茶树花青素还原酶(CsANR)作为原花青素生物合成途径中的关键酶,催化花青素为相应的2,3-顺式-黄烷-3-醇。为了研究该酶的酶学特性,本文采用原核表达及钴离子亲和柱纯化技术,表达并纯化出目的蛋白;重点对CsANR1酶学特性进行研究分析。结果表明,CsANR1的最适反应温度为40℃,最适pH值为6.5;对底物矢车菊色素的亲和力高于飞燕草色素。Cu2+、Co2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+和Hg2+等金属离子对酶有抑制作用,存放15d后酶活下降50%。