嘧霉胺对采后柑橘绿霉病的防治效果

在实验室和贮藏库条件下,对嘧霉胺单剂、嘧霉胺与抑霉唑或嘧霉胺和咪鲜胺混剂防治柑橘绿霉病的效果进行了评价。室内实验结果表明:采用500或1 000 mg/L嘧霉胺单剂、500 mg/L嘧霉胺+500 mg/L抑霉唑或500 mg/L嘧霉胺+500 mg/L咪鲜胺混剂在接种后12~18 h进行浸果处理,对由抑霉唑抗性或敏感菌株引起的绿霉病均有显著的防治效果,防效超过94%;500或1 000 mg/L 的抑霉唑对敏感菌株的防效在93%以上,但对抗性菌株的防效低于70%。贮藏库防效试验结果表明:在具抑霉唑抗性菌系的贮藏库中,上述质量浓度的嘧霉胺单剂、嘧霉胺与抑霉唑、或嘧霉胺与咪鲜胺混剂对绿霉病的防治效果明显优于抑霉唑单剂;而在不具抗抑霉唑菌系贮藏库中的防效则与抑霉唑相当。由此认为:嘧霉胺可作为抑霉唑的替代药剂应用于柑橘的采后处理,其推荐使用质量浓度为500~1 000 mg/L,可单独使用,也可与抑霉唑或咪鲜胺混合使用。     

浙江衢州地区柑橘绿霉病菌对抑霉唑和多菌灵的抗性水平及其分子机制

研究了采自浙江衢州地区,包括柯城区、衢江区和开化县12个贮藏库的70个柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum菌株对抑霉唑和多菌灵的抗性频率、抗性水平及其抗性分子机制。结果表明:柯城区和衢江区的抑霉唑抗性菌株(最低抑制浓度MIC≥0.5 μg/mL)的比例分别为77.1%和62.5%,两地抗性菌株的平均EC50值分别为2.07±1.04 μg/mL和2.35±0.73 μg/mL,分别是当地敏感菌株EC50值的41.4和47.0倍;而采自开化县的菌株均对抑霉唑敏感(MIC≤0.1 μg/mL),平均EC50值为0.04±0.02 μg/mL。柯城区和衢江区的多菌灵抗性菌株(MIC≥10 μg/mL) 的比例分别为54.3%和54.2%,而开化县的抗性菌株比例仅为9.1%。即来自柯城和衢江两个柑橘主产区的绿霉病菌群体对抑霉唑和多菌灵的抗性频率均远高于非柑橘主产区的开化县群体,说明抗药性群体的形成与药剂使用历史有关。进一步研究发现,衢州地区柑橘绿霉病菌对抑霉唑的抗性均属于IMZ-R3型,即与抑霉唑靶标基因 CYP51B 启动子区的插入突变有关,而对多菌灵的抗性则与 β-微管蛋白基因的992位核苷酸点突变(T→A)导致对应的200位点的氨基酸突变(F→Y)有关。     

赣南脐橙绿霉病菌对常用杀菌剂抗性监测

 本文研究了来自赣南7个县的柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)种群对该地区常用杀菌剂抑霉唑、咪鲜胺、甲基硫菌灵和百可得的抗性频率、抗性水平和对抑霉唑的抗性分子机制。结果表明:病菌对抑霉唑和咪鲜胺存在基本一致的抗性;2011和2012年病菌种群对抑霉唑和咪鲜胺的抗性频率分别为82%和90%,平均抗性倍数为51.5倍,抗性分子机制均属于IMZ-R3,即CYP51B基因启动子区发生199 bp插入的突变;病菌种群对甲基硫菌灵的抗性频率分别为82%和91%;病菌种群对百可得均表现敏感。本研究为采后柑橘病害防治药剂选择提供了科学的依据。     

浙江省柑橘绿霉病菌对嘧菌酯的敏感性研究

采用孢子萌发法和生长速率法测定了2000~2006年间采自浙江衢州、杭州、金华、丽水的65个柑橘绿霉病病菌Penicillium digitatum菌株对嘧菌酯的敏感性。结果表明:嘧菌酯对供试菌株 孢子萌发和菌丝生长的EC50值均呈单峰分布,分别介于0.020 1 ~0.260 0 μg/mL和0.005 3 ~0.079 4 μg/mL 之间,平均值分别为0.042 6 μg/mL 和0.025 0 μg/mL。敏感性频次分析结果表明,该65个菌株孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯的敏感性频率分布均符合正态分布,其EC50平均值0.042 6±0.030 4 μg/mL 和0.025 0±0.012 9 μg/mL可分别作为柑橘绿霉病菌孢子萌发和菌丝生长对嘧菌酯的敏感基线。     

柑橘绿霉病菌木聚糖酶基因(PdXY2)功能初步研究

柑橘绿霉病菌(Penicillium digitatum)是引起柑橘储藏期腐烂最主要的病原之一,严重影响了柑橘产业发展。本试验克隆了柑橘绿霉病菌的木聚糖酶基因(PdXY2),对其表达进行研究,在柑橘发病过程中,PdXY2的表达显著升高,至48h达到最高,其表达量为对照的4倍。为进一步明确PdXY2基因功能,构建了PdXY2基因缺失突变株(ΔPdXY2),ΔPdXY2突变株的致病性与野生型相比没有明显差异。由此我们推断,在柑橘绿霉病菌侵染柑橘的过程中PdXY2有一定的作用,但是单一缺失木聚糖酶PdXY2基因不能影响其致病性。     

葡萄白腐病菌对抑霉唑的敏感基线及其与不同杀菌剂的交互抗性

为明确山东省胶东地区葡萄白腐病菌Coniella diplodiella对抑霉唑的敏感性及抑霉唑与常规杀菌剂之间的交互抗性,采用菌丝生长速率法测定葡萄白腐病菌对抑霉唑等杀菌剂的敏感性,并通过分析抑霉唑与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌毒力的相关性,判断抑霉唑与各药剂之间是否存在交互抗性。结果表明,供试69株葡萄白腐病菌菌株对抑霉唑的EC₅₀在0.13~55.53 μg/mL之间,最高值与最低值相差427.15倍;其频数分布图呈多峰曲线,第一主峰内EC₅₀平均值为6.34 μg/mL,可作为胶东地区葡萄白腐病菌对抑霉唑的敏感基线。与敏感基线相比,田间已出现抑霉唑低抗菌株,占检测总株数的8.70%,未检测到中、高抗菌株。选择3个抗性菌株连续继代培养10代后,其对抑霉唑的敏感性明显提高,说明其抗药性不能稳定遗传。抑霉唑EC₅₀对数值与戊唑醇、吡唑醚菌酯、福美双、多菌灵、代森锰锌的EC₅₀对数值之间的相关系数分别为0.799、-0.143、-0.089、-0.268和0.159,说明抑霉唑与戊唑醇存在一定的交互抗性,但与其他4种药剂之间不存在交互抗性。表明抑霉唑可用于胶东地区田间葡萄白腐病的有效防控。     

番茄叶霉病菌对多菌灵、乙霉威及代森锰锌抗性检测

报道了番茄叶霉病菌Fulvia fulva对多菌灵、乙霉威及代森锰锌的敏感性基线,以及抗性频率和抗性水平。离体条件下,多菌灵、乙霉威及代森锰锌对番茄叶霉病菌敏感菌株的平均EC50值分别为0.101、2.475、9.067 μg/mL;最低抑制浓度(MIC)值分别为0.5、5、50 μg/mL 。山西晋南地区番茄叶霉病菌对3种杀菌剂的抗性频率最高,分别达到97.4%、70.5%、98.7%;山西吕梁地区与太原地区相对较低,但该病菌对3种杀菌剂的抗性频率也都超过了30%。辽宁沈阳、山东寿光、河北保定番茄叶霉病菌对多菌灵的抗性频率均为100%;对乙霉威的抗性频率前两地为100%,保定为10%;对代森锰锌的抗性频率都超过90%。所有抗性菌株对多菌灵均属于高抗类型,抗性指数超过5000,测不出MIC值;对乙霉威有50%的高抗菌株,抗性指数在100以上;对代森锰锌各地均未发现高抗菌株,低抗和中抗菌株所占比例较大,其抗性指数集中在50左右。对多菌灵与乙霉威具有双重抗性的菌株占测试菌株总数的49.9%,并且首次在田间发现了对3种杀菌剂都具有抗性的番茄叶霉病菌多抗菌株。     

柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶基因(PdPG2)的表达分析

柑橘绿霉病菌Penicillium digitatum是储藏期柑橘腐烂病最主要的病原之一,严重影响柑橘产业的发展。已有研究表明,柑橘绿霉病菌中多聚半乳糖醛酸酶(PdPG2)对其致病性有重要作用,PdPG2基因功能缺失突变株的致病性会下降,然而有关PdPG2基因的表达研究尚不完善。本文研究了PdPG2基因在不同条件下的表达情况,结果表明PdPG2是酸性表达基因,其表达量随着pH的升高而降低,pH为3.0时其表达量为对照条件下的10倍,pH为8.0时其表达量为对照条件下的0.36倍。柑橘果胶能够诱导PdPG2的表达,其表达量为对照的3.6倍。因此,在侵染过程中PdPG2表达的升高是由于发病部位酸化以及橘皮降解物诱导共同引起的。     

抑霉唑手性异构体及其代谢物在柑橘贮藏中的选择性行为

本研究确定了抑霉唑及其代谢产物咪唑乙醇的绝对构型,建立了一种基于超高效液相色谱-串联质谱检测柑橘不同部位抑霉唑和咪唑乙醇对映体的手性分析方法,并开展了柑橘贮藏过程中抑霉唑的选择性降解行为研究.柑橘(椪柑Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan)果肉、全果和果皮样品通过乙腈(含体积分数1％ 的...     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

长孢轮枝菌Taq〖KG-*4〗Man-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法

长孢轮枝菌是一种在我国局部地区新近出现且危害性极大的植物病原真菌?根据长孢轮枝菌及其近似种的actin序列差异, 设计并合成特异性引物和探针, 建立了长孢轮枝菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能特异性检测长孢轮枝菌; 灵敏度试验结果表明, 最低检测限量为10 μL反应体系中总DNA含量10 pg; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.8 μmol/L, 探针终浓度0.8 μmol/L, 优化后的整个反应过程约1 h?实际样品检测结果表明, 该方法可用于疑似受长孢轮枝菌侵染的萝卜样品检测与初筛?此方法快速?灵敏, 检测过程完全闭管, 无需PCR后续处理, 为早期快速检测长孢轮枝菌提供了重要参考?     

Real-time PCR assay for quantification of Tilletia caries contamination of UK wheat seed

A quantitative real-time PCR assay using TaqMan chemistry has been developed to quantify the level of Tilletia spp. contamination in wheat-seed lots. In the UK wheat seed is predominantly contaminated with Tilletia caries (syn. Tilletia tritici ), and the probability of detecting other Tilletia spp. is negligible. DNA standards, prepared from T. caries spores, were calibrated using a set of 26 seed samples, with T. caries contamination levels ranging from 0 to 1000 spores per seed. The linear calibration model obtained by the regression of log₁₀ (number of spores per seed + 1) on mean log₁₀ DNA ( µ g) produced a coefficient of determination ( R ²) of 0·904. The calibration model was tested using 226 seed samples; of these, 91% fell within the 95% confidence intervals. Of the 21 samples that were outside the limits, 16 were overpredictions and five underpredictions. The five underpredictions were all from seed samples where contamination was less than one spore per seed. The model predicts that samples with 44 pg of DNA will be below one spore per seed with 95% probability. Of the 226 test samples compared with this threshold, 99 contained less than 44 pg DNA, and these were found to have less than one spore per seed by microscopic assay. This real-time assay allows an increase in test throughput and provides the sensitivity required for an advisory threshold of one spore per seed.     

基于TaqMan MGB探针的黑白轮枝菌检测方法

根据黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum)及其近似种β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列差异,设计并合成1对引物和1条Taq Man-MGB探针,建立了黑白轮枝菌的实时荧光PCR检测方法。对供试黑白轮枝菌及其近似种实验表明,该方法特异性强,只有黑白轮枝菌可被检出。通过对反应体系的优化,确定了最佳反应条件:引物终浓度为1.0μmol/L,探针终浓度为0.7μmol/L。灵敏度试验结果显示,最低检测限量为总DNA含量10 pg(20μL反应体系)。此方法快速灵敏,为快速检测黑白轮枝菌提供了重要参考。     

基于TaqMan MGB探针的可可花瘿病菌快速检测方法

可可花瘿病菌是一种我国进境植物检疫性真菌?本文根据可可花瘿病菌EF1α基因的保守序列, 设计并合成1对特异性的实时荧光PCR引物和1条TaqMan MGB探针, 建立了可可花瘿病菌的实时荧光PCR检测方法?特异性试验结果表明, 该检测方法能够特异性检出可可花瘿病菌; 实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.2 μmol/L, 探针终浓度0.6 μmol/L; 灵敏度试验结果表明, 20 μL反应体系中可可花瘿病菌DNA含量最低检测限为10 pg; 重复性试验结果表明, 该检测方法的重复性和稳定性良好; 接种试验样品检测结果表明, 该方法可用于疑似携带可可花瘿病菌样品的检测与初筛?本文建立的方法具有良好的灵敏性?特异性和应用性, 为可可花瘿病菌早期快速检测提供了一种有效手段?     

新型含氮化合物对柑桔绿霉菌的离体抑菌活性及其构效关系

为寻找对柑桔绿霉菌具有抑制作用的活性化合物,采用生长速率法并结合光谱法评价两种商品化三唑类杀真菌剂和四种新型含氮化合物对柑桔绿霉菌的抑菌活性及与柑桔绿霉菌CYP51的结合能力。结果表明:7-甲氧基-2-氢-苯并[b][1,4]噻嗪-3-胺对柑桔绿霉菌表现出强抑制作用,EC50值达1.18mg/L,与商品化三唑类杀真菌剂烯唑醇的EC50值(0.09mg/L)接近;而其余三种新型含氮化合物显示出中等程度的抑制作用,EC50值分别为7.88、10.09和38.56mg/L。不同化合物与异源表达的重组柑桔绿霉菌CYP51的结合能力不同,对柑桔绿霉菌生长抑制的EC50越大,结合常数越大,即化合物与靶标酶CYP51的结合能力与抑菌活性呈正相关。     

Real-time PCR detection systems for Flavescence dorée and Bois noir phytoplasmas in grapevine: comparison with conventional PCR detection and application in diagnostics

A new real-time PCR detection system was developed for grapevine yellows (GY) using TaqMan minor groove binder probes and including two amplicons for group-specific detection of Flavescence dorée (FD) and Bois noir (BN) phytoplasmas, plus a universal phytoplasma amplicon. FD and BN amplicons were designed to amplify species-specific genomic DNA fragments and the universal amplicon to amplify the 16S ribosomal DNA region. Efficiency of PCR amplification, limit of detection, range of linearity and dynamic range were assessed for all three amplicons. The specificity of detection systems was tested on several other isolates of phytoplasmas and bacteria and on healthy field grapevine and insect samples. No cross-reactivity with other phytoplasma strains, plant or insect DNA was detected. The assay was compared with conventional PCR on more than 150 field grapevine, insect and field bindweed samples. Real-time PCR showed higher sensitivity as phytoplasmas were detected in several PCR-negative and in all PCR-positive samples. A data-mining analysis of results from both detection approaches also favoured real-time PCR over conventional PCR diagnostics. The developed procedure for detection of phytoplasmas in grapevine also included amplification of plant DNA co-extracted with phytoplasmic DNA, providing additional quality control for the DNA extraction and PCR amplification for each sample. The newly developed assay is a reliable, specific and sensitive method easily applicable to high-throughput diagnosis of GY.