禽流感新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用

超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原．用点样缓冲液稀释后点于荃基修饰的片基上，制备蛋白芯片：将芯片与待检血清杂交后，再与胶体金标记的二抗杂交．银染显色后根据灰度值判定结果，从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测．结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交，无交叉反应，而且呈现较强的杂交信号，     

双夹心ELISA检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体方法的建立

用胸膜肺炎放线杆菌血清2型(1536)菌液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后免疫大白兔,制备兔高免血清,提纯抗体,建立检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的双夹心ELISA方法.方阵滴定确定最佳反应条件:包被纯化的兔抗App血清2型抗体为9.375 μg/mL,抗原稀释度为1∶1 600,HRP-兔抗猪IgG稀释度为1∶20 000.特异性与敏感性试验结果表明,双夹心ELISA方法特异性好、敏感性高,与猪O型口蹄疫、猪传染性胃肠炎、蓝耳病等阳性血清以及App其他血清型阳性血清无交叉反应.检测样品结果与阻断ELISA比较,其相符率为99.54%,表明双夹心ELISA可用于猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的检测.     

利用可视化蛋白芯片快速检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)是瓜类作物上重要的病原病,需建立快捷、准确的检测方法.以硝酸纤维素膜为固相载体,采用ELISA双抗夹心法建立了对CGMMV的可视化蛋白芯片检测方法,并对捕获抗体稀释倍数、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色温度等进行优化.结果表明,最佳检测条件为:捕获抗体稀释倍数1∶5,样品20℃孵育1h,酶标抗体20℃孵育1h,20℃15min显色.以50批葫芦科种子为样品,对可视化蛋白芯片检测与DAS-ELISA检测进行了比较,其检测结果吻合率达98.0%;经PCR检验,检测结果一致性良好.说明该方法能对植物病毒做出快速、准确的检测.     

猪流行性腹泻病毒IgG抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪血清中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgG抗体的间接ELISA方法,以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒为包被抗原,采用方阵滴定法优化反应条件,建立了2种检测猪血清中PEDV IgG抗体的间接ELISA方法。结果显示,纯化全病毒和重组N蛋白抗原的最佳包被浓度分别为1.00和4.92μg/mL,检测样品最佳稀释度分别为1∶100和1∶50,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性血清的最低检测稀释倍数分别为1∶1 600和1∶800,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒等阳性血清均无交叉反应性,2种方法对临床样品检测符合率为95.92%。这表明2种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价血清中特异性PEDV IgG抗体。     

4种禽病毒抗体可视化蛋白芯片的制备及应用

 【目的】研制可同时鉴别检测AI、ND、IB、IBD等4种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。【方法】用超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了4种病毒蛋白抗原,调整到合适浓度后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;分别用4种禽病阳性血清杂交,再与金标二抗杂交,银染显色后读取结果,建立4种禽病的可视化蛋白芯片工作平台;进一步对此芯片的特异性以及灰度值与抗体浓度的相关性进行了研究;最后对18个现地血清样品进行了初步应用检测。【结果】结果显示经过条件优化后,芯片检测探针可特异性的相应的抗体进行杂交,呈现较强的杂交信号,且无交叉杂交。信号灰度值在抗体浓度为50～300 μg?ml-1范围内成线性关系。用芯片和其它传统抗体检测方法同时检测18份现地样品,结果发现可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且灵敏性明显高于传统检测手段。【结论】研究表明该方法可用于同步鉴别4种禽病抗体,是一种有效的抗体检测新方法。     

鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立

以鸭坦布苏病毒E蛋白的主要优势抗原表位区E1蛋白作为包被抗原,建立检测鸭坦布苏病毒中和抗体效价的间接ELISA方法。优化后确定最佳的抗原包被浓度为1.548mg·L-1,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶6 000。特异性表明,用建立的ELISA方法对禽流感、新城疫病毒、1型鸭肝炎病毒、胰腺型鸭甲肝病毒、禽霍乱和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清进行检测,均未发生交叉反应;批内和批间重复试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶3 200。该方法与以全病毒为包被抗原的间接ELISA检测结果相关性达到95.1%。利用该方法对237份来自福建省开产麻鸭的血清样品进行检测表明,其血清阳性率达77.9%,表明福建省开产麻鸭感染鸭坦布苏病毒阳性率很高。本试验建立的间接ELISA检测方法具有特异性强,重复性好,敏感性高,为鸭坦布苏病毒抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用

该研究利用纯化后的流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E-Ⅲ抗原域蛋白,将其作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法.试验的最佳反应条件为:最佳抗原包被浓度为17.5 μg/mL,血清抗体稀释度为1∶4,酶标二抗稀释度为1∶5 000,封闭液和稀释液用含0.4％ BSA的PBST.采用该方法对127份临床样品进行检测,结果显示,与商品试剂盒检测结果比较符合率达到90.00％.因此,该研究建立的流行性乙型脑炎间接ELISA检测方法具有良好的稳定性和可重复性,并具有较高的特异性和敏感性.     

边界病病毒E2蛋白质的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

边界病病毒(Border disease virus,BDV)是导致绵羊和山羊繁殖障碍的重要病原。为了建立检测BDV特异抗体的ELISA方法,本研究将BDV基因克隆入原核表达载体p ET-32a(+),并构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白质。以纯化的重组表达蛋白质为抗原,建立间接ELISA(r E2-ELISA)检测方法。通过反应条件优化,确定抗原包被浓度4.0μg/ml;封闭液为20 g/L BSA;血清最佳稀释度为1∶50,孵育1 h;二抗最佳稀释倍数为1∶30 000,作用45 min;以TMB为底物显色10 min。用该ELISA方法检测瘟病毒属的CSFV、BVDV阳性血清,结果均为阴性。对187份山羊血清样品进行临床检测,与Svanova试剂盒检测结果阳性符合率为76.25%,总符合率为74.87%;上述检测方法同时与Western blot鉴定结果进行比较,结果显示,Western blot结果与r E2-ELISA检测结果的符合率为79.55%,高于与Svanova试剂盒检测的符合率(72.73%)。表明建立的间接ELISA检测方法可适用于临床BDV血清样品的抗体检测。     

基于番鸭细小病毒VP3蛋白的间接ELISA方法建立

本试验采用经原核表达并纯化的番鸭细小病毒VP3蛋白作为包被抗原，辛酸-硫酸铵沉淀法提取纯化制备的兔抗番鸭IgG酶标抗体作为二抗，经一系列试验，确定了间接ELISA检测番鸭细小病毒抗体的最佳抗原浓度为5 μg·mL^-1，血清的最佳稀释度为1∶100，血清样品稀释液为含10% FBS和10%脱脂奶粉的PBST，兔抗番鸭酶标抗体最适稀释度为1∶2 500。将建立的方法进行了特异性、敏感性、重复性与中和试验的符合性等试验。试验结果表明，阳性血清样品作1 600倍稀释还能检测到抗体；与其他常见鸭传染病的阳性血清无交叉反应；批内、批间重复性试验的变异系数小于8.7%；100份番鸭血清样品用ELISA方法与中和试验的总符合率达90%以上。说明本试验建立的检测方法敏感性高、特异性强、重复性与稳定性好，可用于番鸭细小病毒流行病学调查及鸭群免疫番鸭细小病毒疫苗后抗体监测。     

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。     

兔病毒性出血症Dot-IGSS检测方法的建立

[目的]建立一种检测兔病毒性出血症IgG抗体的斑点免疫金银染色法（Dot—IGSS）。[方法]选择抗原包被浓度20μg/ml,被检血清稀释度1：160;鼠抗兔IgG稀释度1：200、金标羊抗鼠IgG稀释度1：20的工作条件,用所建立的Dot—IGSS与血凝抑制试验（HI）对96头份被检血清进行平行检测。[结果]Dot—IGSS和HI的检测阳性率分别为94％和31％。[结论]所建立的Dot—IGSS是一种灵敏、特异和稳定的血清学捡测方法,适用于兔病毒性出血症的诊断和抗体检测。     

O型口蹄疫病毒间接免疫荧光检测方法的建立

为建立猪O型口蹄疫病毒(FMDV)间接免疫荧光(IFA)检测方法,以猪抗O型口蹄疫病毒阳性血清为一抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的SPA蛋白(葡萄球菌蛋白A)为二抗,通过反应条件的优化,建立检测方法。结果表明,IFA最佳工作条件为,一抗最适稀释度为1∶50,FITC标记的二抗的最适稀释度为1∶800,最适孵育时间均为1h。特异性试验表明,用建立的IFA检测方法只能检测O型FMDV,而A型、AsiaⅠFMDV型和猪水疱病病毒(SVDV)检测结果均为阴性。建立的检测O型FMDV抗原的IFA检测方法具有特异、敏感、简便、快速等优点,可用于FMDV感染的实验室诊断及其在感染机体中的定位和动态分布研究。     

大型溞ChE和NAGase间接竞争和非竞争ELISA方法的比较

[目的]探索间接非竞争ELISA和间接竞争ELISA法测定大型溞ChE和NAGase的试验条件及方法灵敏度。[方法]分别采用间接竞争和间接非竞争ELISA方法测定大型溞ChE和NAGase。[结果]对于ChE,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为1.466μg/m L和1∶10 000,灵敏度为7.426 7 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为5.277μg/m L和1∶8 000,灵敏度为0.163 4 ng/m L。对于NAGase,间接非竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为8.961μg/m L和1∶6 000,灵敏度为4.199 9 ng/m L;间接竞争ELISA的最适抗原浓度和抗体稀释倍数分别为6.450μg/m L和1∶4 000,灵敏度为0.250 8 ng/m L。[结论]无论是ChE还是NAGase,间接竞争ELISA在最适抗体浓度下的检测灵敏度均高于间接非竞争ELISA,加之其操作简便,间接竞争ELISA在生物和环境样品ChE和NAGase含量检测中值得推广应用。     

双夹心ELISA检测鸡EDS-76病毒抗原的研究

应用鸡抗EDS-76病毒、兔抗EDS-76病毒抗体和羊抗兔抗体,建立了检测EDS-76的双夹心ELISA方法,本试验确定的鸡抗EDS-76病毒抗体、兔抗EDS-76病毒抗体和HRP-羊抗兔抗体的最佳工作浓度分别为1∶160、1∶300和1∶1000。本法对纯化EDS-76病毒的最低检出量约为5 ng/孔。通过对EDS-76病毒试验感染鸡脏器带毒、排毒情况和临床样本的检测,表明双夹心ELISA方法对EDS-76病毒的检测特异性强、敏感度高、适合于成批样本的检测。     

港口航道致病性细菌检测微阵列基因芯片的研制

[目的]制备出一套针对港口航道致病性细菌检测的基因芯片,为港口航道基因芯片检测技术的研究及应用打下基础.[方法]采用常规方法提取目标菌株基因组DNA,以16S rDNA通用引物和gyrB基因保守区引物进行PCR扩增,使用AlleleID 6.0和Array Designer 4.25对扩增获得的目的片段进行寡核苷酸探针设计,经PCR筛选验证,目标探针以氨基化修饰后通过芯片点样仪点制在醛基玻片上;优化芯片杂交固定条件,并用于港口航道的水样检测,以验证微阵列基因芯片的检测效果.[结果]优化后的芯片杂交固定条件为探针点样浓度10μmol/L、紫外交联时间2.0 h、杂交温度65℃,有效提高了基因芯片检测的灵敏度,与传统检测方法相比可实现快速、高通量、准确的目标.研制的微阵列基因芯片可特异性检测出港口航道中含有的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Emterobacter cloacae)、溶藻弧菌(V.alginolytivus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和创伤弧菌(V.vulnificus)等7株致病性细菌,且均未出现非特异性杂交.[结论]针对港口航道致病性细菌建立的微阵列基因芯片检测技术具有特异性强、灵敏度高、快速便捷的特点,可用于港口航道及周边地区的海洋环境监测和海产品质量安全检测.     

基于BP人工神经网络算法的苹果制干适宜性评价

【目的】 建立苹果原料制干适宜性评价模型,实现基于苹果原料指标预测干制品品质的目标,为苹果制干专用化原料的筛选提供方法依据,为明确苹果干制品品质形成的基础物质提供数据支持。【方法】 以来自7个不同主产区的21个主栽品种,共34份苹果鲜果样本为研究对象,运用多种数据处理方法建立苹果脆片品质综合评价模型与苹果原料制干适宜性评价模型。（1）利用压差闪蒸干燥方法制备34份苹果鲜果的脆片样本,测定苹果脆片17项品质指标,采用因子分析进行降维并筛选得到苹果脆片品质评价核心指标,运用层次分析法得到脆片核心指标权重值,构建脆片品质综合评价模型并计算得到脆片综合评价得分。（2）测定34份苹果鲜果样本22项品质指标,与脆片核心指标进行相关性分析并筛选出与脆片品质相关的果实特征指标。选用29个样本以果实特征指标为输入,对应脆片综合评价得分为输出,利用误差反向传播（Error Back Propagation, BP）神经网络算法构建学习模型;其余5个样本为验证样本,评价学习模型的预测准确性。变换3组学习样本构建3个学习模型,对比3个模型的预测准确性,验证建模方法的合理性与稳定性。【结果】 苹果脆片L*值、脆度、膨化度、可滴定酸含量、可溶性糖含量和粗蛋白含量被确定为不同样本脆片品质综合评价的核心指标,构建的苹果脆片品质综合评价模型为Y_综合得分=L*值×0.3724+脆度×0.2665+膨化度×0.1583+可滴定酸含量×0.0890+可溶性糖含量×0.0569+粗蛋白含量×0.0569。34个苹果鲜果样本制得的脆片综合得分范围为0.2069—0.7933,存在较大差异,得分排名前3的苹果样本为‘辽宁华红’‘辽宁华金’和‘山东烟富6号’,排名最后的苹果样本为‘陕西秦冠’。基于脆片核心指标与苹果果实品质指标相关性分析结果,筛选出苹果果实的果形指数、果肉a*值、pH、可滴定酸含量、Vc含量、果核比例、粗蛋白含量、果肉b*值、密度、可溶性固形物含量、粗纤维含量、总糖含量12项指标作为果实制干适宜性评价的特征指标。以果实特征指标值为输入层,对应苹果脆片综合评分为输出层,建立BP神经网络学习模型,可实现苹果原料制干适宜性的定量预测。该方法建立的学习模型有较高的预测准确性与稳定性,变换学习样本得到的3个学习模型的预测值与实际值相对误差均不超过10%,实际值与模型预测值线性拟合后决定系数R ²均大于0.95。【结论】 苹果制干适宜性可由果实的果形指数、果肉a*值、pH、可滴定酸含量、Vc含量、果核比例、粗蛋白含量、果肉b*值、密度、可溶性固形物含量、粗纤维含量、总糖含量12项指标进行评价,建立的适宜性评价模型可实现基于苹果原料指标定量预测其制干适宜性。     

猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法.克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物.以纯化重组Cb...     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95.56%;间接血凝试验结果效价在1∶16以上(含1∶16)的血清样品为88份,占总样品比例的97.78%,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。