基因枪介导转化水稻花粉获得转基因植株

植物花粉是一种理想的植物遗传转化材料,利用转化后的花粉授粉,借助于植物胚胎的自然发育获得转基因种子,从而简化转化过程.大量研究表明基因枪是花粉转化的较理想工具,目前基因枪介导的花粉转化只在烟草、油菜等少数作物中获得成功.水稻是世界主要粮食作物,建立一个高效的水稻遗传转化体系对于水稻的遗传改良具有十分重要的意义.     

水稻中抑制衰老的嵌合基因的基因枪转和表达分析

利用基因枪法把抑制衰老的嵌合基因导入水稻恢复系ＨＰ１２１和偏籼型品系８７０６，经ＰＣＲ，点杂交以及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，证明外源基因已整合到水稻基因中。通过叶片细胞分素含量和叶绿素含量的测定以及形观察，表明抑制衰老的嵌合基因 部分转基因水稻中表达，叶片衰老得到延迟。转基因植标后代符合３：１遗传规律。     

水稻中抑制衰老的嵌合基因的基因枪转化和表达分析

利用基因枪法把抑制衰老的嵌合基因导入水稻恢复系HP121和偏籼型品系8706,经PCR、点杂交以及Southern杂交分析, 证明外源基因已整合到水稻基因组中.通过叶片细胞分裂素含量和叶绿素含量的测定以及形态观察,表明抑制衰老的嵌合基因在部分转基因水稻中表达,叶片衰老得到延迟.转基因植株后代符合3:1遗传规律.     

水稻几丁质酶基因的克隆及序列分析

采用ＰＣＲ技术从水稻基因组ＤＮＡ中扩增出２个编码几丁质酶基因片段ＲＣＨ１０和ＲＣＨ８,片段大小分别为１０２３ｂｐ和９７６ｂｐ。将ＰＣＲ产物直接做ＮＤＡ序列分析,证明扩增出的２个片段具有编码Ⅰ类几丁质酶的基本结构,即（１）Ｎ－端信号肽区;（２）ｈｅｖｅｉｎ ｄｏｍａｉｎ结构区;（３）可变间隙区;（４）催化结构区。其中ＲＣＨ１０的核苷酸序列与文献报道相比同源性为９７％,氨基酸序列同源性为９３％;ＲＣＨ     

用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得

用水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａＬ．）的幼胚、愈伤组织作受体,采用ＰＩＧ基因枪法,成功地将苏云金杆菌毒蛋白基因〖Ｂｔ毒蛋白基因,ｃｒｙＩＡ（ｂ）〗和马铃薯蛋白酶抑制剂基因（ｐｉｎⅡ基因）连同抗除草剂Ｂａｒ基因分别转入不同的水稻中,获得大量的转基因植株。Ｓｏｕｔｈｅｎ杂交分析途中外源抗虫基因均分别整合到水稻的基因组中。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交分析显示它们在水稻叶片中表达的水平较高。外源基因在一代中遵循３     

基因枪法转化小麦幼胚瞬时表达

自Vasil et al．（1996）利用基因枪将获得小麦对除草剂Basta具有抗性的再生植株以来，基因枪介导的小麦遗传转化研究发展很快（Altpeter et al．，1996）。在小麦基因枪转化中，优化基因枪转化因素，提高转化效率仍然是基因转化的关键问题。本实验研究了不同金粉用量、质粒DNA浓度及轰击枪数对小麦幼胚瞬时表达的影响，通过GUS染色和细胞压片，分析了gus基因的瞬间表达。     

直接产生抗除草剂转基因水稻纯系的新方法

提出了一种提高转基因杂交后代育种选择效率的新途径，即在花药培养过程中添加抗性筛选物质，直接筛选含有目的基因的纯合体。以转bar基因水稻植株和非转基因植株杂交F1为试格进行花药培养，并对分化的绿苗进行PCR检测和田间抗性检测。结果表明，在愈伤组织诱导培养基和分化培养基中分别添加PPT0.05mg/L与未添加PPT的对照，均产生较多的愈伤组织和绿苗，并有较高比例不抗除草剂的假阳性株。当PPT浓度增至0.1mg/L时，所得花培苗全部抗除草剂，显示很好的筛选作用。PPT浓度继续增加，愈伤组织诱导率和绿苗分化率急剧下降。当PPT的浓度增至5mg/L时，愈伤组织的诱导和幼苗分化完全被抑制。对30个加倍单倍体系作连续两代农艺性状考察，约73％以上的株系在遗传率较高的性状中，变异系数很小（＜10％），说明这些株系的基因型已经纯合，证实了该方法的有效性。     

高赖氨酸蛋白质基因和bar基因导入水稻及转基因植株的检测

构建了1个含高赖氨酸蛋白质基因和bar基因的植物表达载体，用基因枪法将其分别导入籼稻(Oryza sativa ssp．indica)中优早5号幼胚和龙特甫B成熟胚诱导的愈伤组织中，筛选后得到16株可育的再生植株。PCR和Southern blot检测结果表明，外源基因已整合到水稻的基因组中。T1代植株表现出对PPT的抗性。对部分T1代转基因水稻种子进行分析表明，中优早5号种子中蛋白质含量(12．07％～16．2％)和赖氨酸含量(0．52％-0．67％)分别提高了35．18％和45．09％，龙特甫B种子中蛋白质含量(11．92％，12．87％)和赖氨酸含量(0．51％-0．57％)分别提高了27．69％和16．15％。     

一个新的水稻低温应答类糖基转移酶基因(OsCrGtl)的表达分析与克隆

采用Affymetrix60K水稻基因表达芯片系统分析了水稻培矮64S（Oryza sativa ssp.indica）在低温、高温和干旱条件下不同生育时期的叶片与穗全基因组的转录丰度,筛选出一个类糖基转移酶基因OsCrGtl（Oryza sativ a cold responsive glycosyltransferase-like gene,GenBank登录号为FJ828672）,该基因主要受低温诱导且在各生育时期的表达量均显著上调。用实时定量RT-PCR方法对该基因的在逆境条件下的转录丰度进行了验证分析,也得到与基因芯片分析基本相同的结果。以培矮64SmRNA为模板,通过RT-PCR方法扩增,得到包含其完整开放阅读框的cDNA克隆。根据其开放阅读框的核苷酸序列推测,OsCrGtl编码一个包含462个氨基酸残基的蛋白质,理论分子量为50.327kD,等电点为5.35。查询蛋白质数据库,得知该基因编码的蛋白质与籼稻（indica）、粳稻（japonica）、玉米（Zea mays）及拟南芥（Arabidopsis thaliana）编码的糖基转移酶家族蛋白相似,且包含糖基转移酶结构域。对其推测的启动子区域核苷酸序列进行分析,找到9个可能与逆境应答有关的顺式作用元件。     

TRV介导的葡萄叶片VvANR基因瞬时表达分析

为建立葡萄叶片TRV-VIGS系统,分析验证VvANR基因功能,本研究以烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导基因沉默表达载体pTRV2-ANR,采用真空侵染和主叶脉针孔注射法分别侵染葡萄幼嫩、成熟叶片,观察表型并测定原花青素含量,实时荧光定量PCR测定被侵染叶片中VvANR及其相关基因表...     

抗生素FR-008基因簇上游区域的DNA序列分析

链霉菌FR-008产生一种七烯大环内酯类抗生素FR-008，对真菌具有很高的抗菌活性，并对蚊子幼虫有高毒性（袁德军和周启，1990）。负责合成FR-008的基因簇被定位（Hu et al．，1994），有21个基因（共138kb，GenBank accession number AY310323）被确认参与了抗生素FR-008的生物合成以及调节和外运（Chen et al．，2003）。然而，在FR-008基因簇最左端fscO基因上游的基因是否与FR-008抗生素生物合成相关？为此，本研究对FR-008基因簇上游区域进行了序列测定和分析。     

香鱼抗凝血酶基因(AT)cDNA的克隆、序列分析及组织表达特征

抗凝血酶(antithrombin,AT)主要抑制凝血酶(thrombin)及其它凝血因子的活性,并具有重要的抗炎活性。本实验从香鱼(Plecoglossus altivelis)肝组织cDNA文库中成功获得了香鱼AT基因的cDNA全序列(EMBL登录号:FN429980)。测序结果表明,香鱼AT基因cDNA全长1487个核苷酸,包含1个大的开放阅读框(ORF),推测编码1个由453个氨基酸组成的蛋白,N端23个氨基酸为信号肽序列。成熟AT具有与哺乳动物AT相似的特征结构,包括:羧基末端附近的丝氨酸蛋白酶活性中心、6个保守的Cys残基形成的3个二硫键结构和4个N-糖基化位点。氨基酸序列分析表明,香鱼AT与大西洋鲑(Salmo salar)AT氨基酸序列同源性最高,为81%。系统进化树分析表明,物种AT的进化关系与目前接受的物种分类关系基本一致,香鱼AT位于鱼类AT簇中,与大西洋鲑、红鳍东方豚(Takifugu rubripes)和斑马鱼(Danio rerio)AT进化相关性最高。AT mRNA在健康香鱼的肝组织中表达量最大,在脾、肾和脑中表达量较低。实时荧光定量PCR结果表明,在鳗利斯顿氏菌(Listone...     

离子束介导玉米DNA的水稻变异后代AFLP分析

利用离子束介导法将玉米（郑单14）DNA片段转入水稻豫粳6号,经过5年的筛选得到了基本稳定遗传的变异株系。本研究通过对64对AFLP选扩引物的筛选,优选出了18对选扩引物,它们能同时在2个变异株系中扩增出大量的DNA指纹条带,并且同时能扩增出差异带以及“目的带”。用AFLP分子标记初步分析了2个变异株系与对照间的差异,变异株系中出现了新带、缺失带和“目的带”等几种情况,这些DNA水平上的差异,表明离子束介导玉米DNA育成的水稻材料可能已经插入了玉米的DNA。     

利用RNA干扰技术抑制水稻淀粉极限糊精酶基因表达

构建了含极限糊精酶基因片段反向重复结构的RNAi载体,抑制水稻籽粒中极限糊精酶基因表达获得了极限糊精酶基因功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实,成功地构建了胚乳特异表达启动子启动的水稻极限糊精酶基因反向重复结构RNAi载体;通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导水稻(Oryza sativa sp.japonica)转化,经PCR及Southern杂交检测,获得28个水稻转基因再生株系;以极限糊精酶抗体对转基因株系胚乳发育期籽粒蛋白质进行Western杂交,并经SDS-PAGE极限糊精酶活性检测,结果显示,该反向重复结构在胚乳发育期表达,减少了极限糊精酶的积累,获得了不同沉默效果的转基因株系。转化株系012的极限糊精酶活性只有野生型的10%,表明该载体可有效地抑制水稻胚乳中极限糊精酶的活性。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素（MBL）基因的克隆及序列分析

甘露聚糖结合凝集素(MBL),又称甘露聚糖结合蛋白(mannan/mannose-binding protein,MBP),是C型凝集素超级家族中胶凝素家族成员.目前,关于MBL的研究在人、小鼠和大鼠上已经相当详尽,在牛、猪、马、弥猴、黑猩猩、狒狒、兔和鸡上也有一定的研究,除鸡外,其余的都已发现2种MBL:MBL-A(血清型)和MBL-C(肝型),但在绵羊上仍为空白.本实验以绵羊的基因组DNA为模板,借助人、牛MBL的保守序列来获得绵羊MBL基因片段.     

白叶枯病菌诱导水稻特异基因表达的微阵列分析

应用水稻（Oryza sativa)2200条非冗余表达序列标签（EST）所制备的cDNA微阵列及同位素^33P杂交体系，对水稻抗白叶枯菌近等基因系中早14R、中早9S经白叶枯病菌（Xanthomonas oryaepv.oyzae(Xoo)）诱导后特异基因表达模式进行研究。结果表明：四叶期诱导3h后，在1336对有效数据所代表的基因中表达丰度上调有315个，下调有176个，对其中78个受诱导的已知功能基因进一步分析表明：cDNA微阵列上基因表达变化反应了植物防卫反应中基因表达的协同作用以及对病原物的攻击作出防卫反应的基本模式，尽管以往研究中一些基因未明确与植物抗病有直接关系。但在供试材料受白叶枯菌诱导后却发现其表达量发生了明显改变，对此作了初步讨论，另外，实验结果还发现了多个受白叶枯菌强烈诱导但功能未知的相关基因。