马传染性贫血病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

 采用PCR方法分 3段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株 (EIAVDLA)的前病毒DNA ,这 3个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组 ,PCR产物经克隆后顺次连接 ,获得 1个含有EIAV全基因 (8.0kb)的重组质粒 ,将其命名为p8.0。将此 8.0kbEIAV全基因再亚克隆到含有一完整EIAVDLA株长末端重复序列的质粒中 ,获得一含有EIAV驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒 ,将其命名为p8.2 ,经核苷酸序列分析 ,证明p8.2含有EIAV前病毒的全基因。用p8.2转染驴白细胞 ,将其作为种毒进行传代 ,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶活性 ,说明在驴白细胞中由p8.2衍生出了EIA病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后 ,第 4天出现病变 ,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子 ,进一步证明p8.2具有感染性 ,笔者获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆 ,为进一步在分子水平上阐明我国EIAV疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础     

不同毒株马立克氏病病毒囊膜糖蛋白gI基因的克隆与序列分析

根据马立克氏病病毒（MDV）国际标准株GA的基因序列，设计全盛一对引物，通过PCR技术，分别以弱毒株814和广西分离强毒株G2株基因组为模板，扩增获得预期大小的PCR产物，将PCR产物和pUC18分别经BamH I株和Sma I酶切后，连接、转化TG1，筛选获得了814－gI和G2-gI的基因克隆，将所得克隆进行测序，并将它们与已发表的MDV其他毒株gI的序列进行比较分析，获得了它们的同源性，绘制了系统发生树。     

猪乙脑病毒河南分离株CSF.ZMD-3的分离鉴定及分子进化分析

采集河南省规模化猪场流产母猪死胎脑脊液作为样本,通过细胞盲传培养分离乙型脑炎病毒流行毒株,对新分离的病毒进行分子生物学鉴定,获得1株分离株并命名为CSF.ZMD-3。DNA序列测定及比对分析该分离株与已报道毒株基因的序列同源性,确定该分离毒株为乙脑病毒。使用MEGA3.1软件对CSF.ZMD-3毒株主要结构蛋白E蛋白的基因序列进行分子进化分析,确定CSF.ZMD-3为基因Ⅲ型乙脑病毒。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株生物学特性的研究

对从吉林省分离的鹅副粘病毒NA-1株应用SPF鸡胚进行传代,通过电镜形态学观察、HA及HI试验、血清学鉴定、毒力鉴定、AGID试验、血凝谱的测定、动物感染试验等一系列研究,发现NA-1株属于禽副粘病毒Ⅰ型,具有新城疫病毒速发型相似的毒力,属于强毒力毒株,遗传进化树分析属于基因Ⅶ新城疫病毒。该病毒对鹅、鸡均具有高致病性。     

鸡新城疫病毒强毒株的分离与鉴定

从河北、天津、北京等省市发病鸡群中分离到8株有血凝性的分离物,其血凝作用可被新城疫阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS76阳性血清所抑制,表明8株分离物均为新城疫病毒。利用鸡胚终点稀释法对这8株NDV进行了克隆。对8株NDV的毒力指数(MDT、ICPI、IVPI)测定结果显示:MDT在42 9～49 5h之间,ICPI在1 95～2 00之间,IVPI在2 68～2 89之间。表明8株NDV均为新城疫病毒强毒株,其毒力与标准强毒株F48E8相近。各分离毒株经2%磷钨酸负染后,电镜下观察,可见丝状、圆形或不规则形态的病毒粒子,表面有纤突样结构。各毒株的大小不尽相同,粒子直径或长轴在100～500nm之间。     

1株抗肿瘤新城疫病毒的毒力分析

[目的]分析1株抗肿瘤新城疫病毒(NDV)的毒力。[方法]通过传统毒力的测定方法,测定此株NDV的最小致死量的平均死亡时间(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及静脉致病指数(IVPI)。通过RT-PCR扩增此株病毒基因组的多个片段,相邻扩增片段之间有部分核酸序列重叠且覆盖完整的融合蛋白(F)基因和血凝素神经氨酸酶(HN)基因的区域,并进行测序。[结果]此株NDV的MDT为105.6h,ICPI约为0.26,IVPI为0。测序结果表明,此株病毒是1株新的NDV,其F蛋白剪切位点为112RRQRRF117。[结论]此株NDV为弱毒株,其F蛋白剪切位点与强毒株一致。除F蛋白剪切位点外,NDV的毒力必然与其他因素相关。     

鹅源副黏病毒的分离鉴定及部分特性研究

采用9日龄鸡胚,从长春某个体养鹅户的病死鹅的肝、脾和肾脏中分离到1株病毒,暂定名为JG04株。经HA和HI试验、电镜观察、常规RT-PCR、NDV荧光RT-PCR检测,证实JG04株为鹅源副黏病毒。与GenBank下载的9株NDV毒株的HN基因作同源性比较,并进一步对JG04株进行耐酸试验、氯仿和乙醚敏感试验、血凝解脱及血凝素热稳定性试验、EID50、ELD50和毒力测定。结果表明:JG04株与江苏近年来分离的鹅源副黏病毒株的HN基因同源性较高,核苷酸同源性高达96.4%,氨基酸同源性高达96.9%;JG04株有良好的血凝性,能凝集人和鸡的红细胞;电镜观察病毒粒子有囊膜,直径约200 nm;对酸、氯仿、乙醚敏感;血凝解脱为快速解脱型,血凝素热稳定性差;EID50、ELD50分别为1.74×109/mL、2.57×109/mL;MDT为54.2 h,ICPI为1.66,IVPI为2.60。上述结果表明,GJ04株与新城疫病毒(NDV)速发型具有类似的毒力,属强毒力毒株。     

1株赛鸽新城疫强毒株的致病特性及分子特征分析

为了解赛鸽群中新城疫流行毒株的分子遗传特征及变异情况,从河北省疑似赛鸽新城疫病例中采集病料,常规处理后接种SPF鸡胚,经血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)鉴定病毒,并对分离毒株进行致病性试验、毒力测定,采用RT-PCR方法扩增F基因,并与其他不同种属新城疫毒株进行遗传进化发育分析和氨基酸序列同源性分析。结果显示,从病料中分离到1株新城疫病毒(命名为HB株),致病性试验产生与发病鸽相似的临床症状和剖检变化;其鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)和6周龄雏鸡静脉致病指数(IVPI)分别为52.8 h、1.78和2.59,表明HB株新城疫病毒为强毒株;HB株F基因碱基序列包含1个大小为1 662 bp的完整开放阅读框,基因分型结果显示,HB株属于基因型Ⅵ型。根据遗传进化发育关系和同源性分析结果发现,HB株与pi/CH/LGD/110208、dove/Italy/2736/00、Q-GB 506/97等毒株核苷酸序列相似性和氨基酸同源性较高,尤其与pigeon/Qinghai/1344/2017毒株亲缘关系最近,分别达98.45%和99.5%;与目前使用的传统新城疫疫苗毒株LaSota、B1、V4、Mukteswar株等遗传关系较远;F蛋白裂解位点氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),符合强毒株特征。以上结果表明,HB株为强毒株且与目前广泛使用的新城疫疫苗毒株遗传关系较远。     

鸽新城疫病毒的分离与鉴定

将分离的疑似新城疫病毒采用蔗糖密度梯度离心对病毒液进一步纯化,经透射电镜观察,可见该疑似病毒具有新城疫病毒直径大小相符的病毒粒子以及囊膜、纤突等形态特征。根据GenBank中注册的新城疫病毒F基因序列分别设计一对特异引物,采用RT-PCR方法扩增相应的目的片段,将cDNA片段分别克隆至pMD-18T载体进行序列测定,获得一株新城疫F基因的部分序列:长度为1625bp,属于基因Ⅶ型,F蛋白氨基酸的裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的强毒株特征;F0氨基酸序列中有6个糖基化部位点和3个与病毒融合相关的重要抗原位点。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒的分离及其N基因序列分析

通过病毒形态观察、血凝特性试验、病毒干扰实验、动物回归实验等分离鉴定了1株鸡肾型传染性支气管炎病毒,命名为LY07.利用RT-PCR技术对分离毒株的N基因进行了扩增,经克隆、序列测定和分析比较,结果表明,N基因全长为1230 bp,编码1条409个氨基酸组成的多肽;其核苷酸与H52、M41和BJ等毒株的同源性为84.4 %～89.7 %,氨基酸同源性为86.1 %～91.0 %;LY07株与LX4、BJ和GDS14株关系较近,与其余鸡传染性支气管炎病毒株的亲缘关系均较远,是1株新的肾型IBV毒株.     

马传染性贫血病毒在慢性感染体内的抗原变异

应用在日本发离的马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）强毒株Ｐ３３７－Ｖ７０实验感染了１匹健康马，经２次感染后，这匹实验感染并未呈现临床症状。从这匹马的外周和肝组织获得了覆盖马传染性贫血病毒ｇｐ９０基因主要中和抗原功能区（ＰＮＤ）的前病毒序列。通过对这些序列的比较分析发现，一些序列在ＰＮＤ功能区含有核苷酸的插入变异。     

Evolutionary Patterns of the Proviral gp90 V3 to V5 Regions of Equine Infectious Anemia Virus Associated with Immune Selection in Progressors and Nonprogressors

The aim of this study was to determine the genomic evolutionary pattern of virulent equine infectious anemia virus (EIAV)during persistent infection.The evolutionary dynamics of proviral genomes were examined by challenging an EIAV seronegative equine (pony 1) and three EIAV vaccinated equines (ponies 4,7,and 8) with the Chinese virulent strain EIAVL.Ponies I and 7 succumbed to disease and were called progressors,while ponies 4 and 8 lacked clinical symptoms and were considered nonprogressors.Sequences spanning the V3,V4,and V5 hyper-variable regions of the EIAV-L envelope gp90 gene were sequenced from each pony as evolutionary markers of the provirus.The proviral genome of the EIAV-Linoculum evolved during persistent infection and displayed different patterns between EIA progressors and nonprogressors.Inoculum-like variants were isolated from nonprogressors during persistent infection,but only from progressors during acute infection.Variant mutations from nonprogressors were dispersed throughout the sequenced region,while those from progressors were predominantly localized to V3.Humoral immunity and virus variant population selection analyses indicated that immune selection was positive in chronically infected progressors and weak in nonprogressors.In-frame stop codons were frequently localized to a defect "hot spot".The high number of defective variants in nonprogressors may promote disease survival.     

Characterization of multipotent mesenchymal stem cells isolated from equine umbilical cord blood

Properties and characteristics of multipotent mesenchymal stem cells (MMSCs) isolated from equine umbilical cord’s blood in vitro have been studied. The cells had morphology similar to fibroblast, high adhesive capabilities, and immunophenotype CD31^–, CD34^–, CD90⁺. Analysis of sensitivity of MMSCs to the equine infectious anemia virus (EIAV) was conducted. The immunocytochemical analysis detected expression of the p26 antigen in MMSCs that are being infected with EIAV. The results obtained show that MMSCs isolated from equine umbilical cord blood can be applied in veterinary virology.     

马传染性贫血病马与弱毒疫苗免疫马的区别试验

 本文应用淋巴细胞杂交瘤技术研制出具有抗马传染性贫血病驴白细胞弱毒抗原株系特异性的单克隆抗体（McAb）的酶结合试剂，以斑点试验（DB）与琼脂免疫双扩散试验（ID）相结合的方法，用于马传贫病马与马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马血清抗体的鉴别。使用本方法对339匹实验马进行测试，共检出马传贫病马11匹，马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马239匹，既未接种弱毒疫苗又未感染马传贫马89匹。另外，对106匹人工马传贫病马和21匹马传贫弱毒疫苗免疫马作了病理学验证，结果与免疫学检测相符。疫区在清除病马之后，病情停息。疫苗免疫马经贸易成交，更换畜主后，再次检疫未发现马传贫病例。结果表明，本方法对马传贫病马与马传贫驴白细胞弱毒疫苗免疫马的区别诊断有实用价值。     

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

 【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50?mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。     

鸡贫血病毒安徽分离株感染性克隆的构建及其感染特性

鸡贫血病毒（chicken anemia virus,CAV）是诱导雏鸡发生免疫抑制的重要病原之一。应用PCR方法从安徽某鸡场送检病鸡肝组织中检测并鉴定CAV,扩增病毒全基因组序列插入pcDNA3.1(+)载体,并引入含Kpn I （GGTACCCAG）酶切位点的9 bp外源性标签,获得顺次连接的双拷贝CAV基因组的重组质粒,通过脂质体介导转染鸡MDCC-MSB1淋巴细胞并拯救出CAV感染性克隆毒株。经动物试验,感染性克隆毒株在接种1日龄健康雏鸡后15 d,对胸腺等免疫器官指数影响较小,胸腺病变不明显,表明其感染能力减弱,为进一步分析CAV致病机制和筛选疫苗候选株奠定基础。     

新疆南疆驴源H3N8亚型EIVHA基因序列分析

为明确新疆南疆驴是否感染马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)及驴源EIV HA基因特征,根据GenBank登录的EIV基因序列,设计合成1对引物,采集新疆南疆地区2个驴屠宰点33份驴肺组织样品,采用RT-PCR扩增驴源EIV HA基因片段,并对扩增产物进行测序与序列分析。结果表明,中国新疆南疆驴源EIV A/donkey/Xinjiang/1/2015(H3N8)株HA基因长1 704bp,编码567个氨基酸。同源性分析结果显示,与国内外H3N8亚型EIV参考毒株核苷酸和氨基酸同源性分别为88.9%~99.9%和88.3%~99.8%,与国内毒株和哈萨克斯坦毒株在一个进化分支内。与GenBank数据库中唯一1个驴源毒株A/donkey/Xinjiang/5/2007(H3N8)的比对结果显示,2个毒株裂解位点、糖基化位点、抗原位点和受体结合位点氨基酸完全一致,只是错位2个氨基酸。确定新疆南疆存在驴感染EIV,可能为国内疫情的延续或周边国家传入。