家蚕钙网蛋白的基因结构与初步表达谱研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)是内质网/肌浆网主要的Ca2+结合蛋白,在细胞功能的调节方面发挥重要作用。利用双向电泳技术及质谱技术研究家蚕脂肪体蛋白组的变化,通过分析检索蛋白质组数据,获得了钙结合蛋白的氨基酸序列。通过电子克隆、cDNA3′末端快速扩增(3′rapid amplification of cDNA ends,3′RACE)方法克隆了家蚕钙网蛋白基因cDNA全长序列,命名为BmCRT(GenBank登录号:FJ360528)。BmCRT基因cDNA全长1 705 bp,开放阅读框序列(ORF)长1 197 bp,编码398个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BmCRT与其它物种的CRT都具有保守的N-结构域、脯氨酸富集结构域和C-端结构域。BmCRT基因组结构分析表明:该基因由7个外显子和6个内含子组成。分析BmCRTmRNA在不同发育时期的表达变化显示,该基因在家蚕幼虫眠期的mRNA表达量比食桑期高,而在4龄和5龄食桑期mRNA表达量没有随着生长变化而变化。     

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位

富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。     

家蚕质型多角体病毒感染应答的假定蛋白基因全长cDNA克隆与表达特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个差异表达的假定蛋白基因。利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了该假定蛋白基因的全长cDNA。用生物信息学方法进行基因序列与结构分析表明:该基因全长cDNA序列为486bp,包含108bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和153bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR),开放阅读框(ORF)为225bp,编码74个氨基酸,蛋白分子质量为6.888kD,等电点为5.27;该基因由3个外显子和2个内含子组成,ORF位于第2外显子内,编码蛋白含二次跨膜结构,多肽链表现为疏水性,在多肽链上的第15～16氨基酸残基可能是信号肽的切割位点。RT-PCR结果显示该基因在家蚕5龄幼虫的丝腺、血液、脂肪体、生殖腺及中肠组织中均有表达;荧光定量PCR结果表明该基因在感染Bm-CPV的家蚕中肠组织中的表达水平为正常家蚕中肠组织的6.28倍。研究结果为进一步解析该基因的功能奠定了基础。     

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

家蚕精巢特异性蛋白激酶基因Bm-TSSK的克隆及序列与表达分析

睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)首先在哺乳动物中被发现,是一类在精子发生过程起重要作用的蛋白激酶。通过EST同源筛选方法,用人(Homo sapiens)的TSSK2、TSSK4、TSSK6基因cDNA和小鼠(Mus musculus)的TSSK1、TSSK3、TSSK5基因cDNA为探针在GenBank家蚕EST数据库中搜索同源基因,通过在家蚕基因组数据库的同源性检索以及电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了Bm-TSSK基因完整的开放阅读框(ORF),序列分析及同源性比对表明:Bm-TSSK序列长1 402 bp,ORF为1 041 bp,没有内含子,推测编码346个氨基酸残基,在编码氨基酸序列20～284区域有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域;该基因推导的氨基酸序列在进化上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、熊蜂(Bombus terrestris)、顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的亲缘关系较近,相似度分别为81%、86%和85%。基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,推测Bm-TSSK参与了家蚕精子的形成。     

家蚕真核翻译起始因子3f基因结构与表达研究

在对家蚕5龄丝腺cDNA文库测序的过程中,发现一个编码家蚕翻译起始因子基因(eIF3f)的EST序列。利用电子克隆、3′RACE(3′rapid amplification of cDNA ends)方法克隆了家蚕eIF3f基因cDNA序列全长,命名为eIF3f(GenBank登录号为DQ868530)。家蚕eIF3f基因cDNA全长为1 009 bp,由870 bp的开放阅读框序列(openreading frame,ORF)、55 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)和65 bp的3′端非编码区序列(3′-UTR)组成,编码289个氨基酸。氨基酸序列比较分析显示,家蚕eIF3f与其他物种的eIF3f都具有翻译起始功能所必需的JAB_MPN结构域。家蚕eIF3f基因组结构分析:该基因由5个外显子和4个内含子组成;5′调控序列存在E74A、DFD、DRI等多个潜在的转录因子结合位点,但没有TATA盒启动子序列。家蚕eIF3f基因的表达在不同组织和不同发育时期存在差异,eIF3f是一种负调控翻译起始因子。研究结果有助于进一步研究真核翻译起始因子的相关基因调控规律。     

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

家蚕滞育激素受体基因(BmDHR)的分子克隆及定量分析

家蚕滞育激素受体(BmDHR)能特异性地识别滞育激素(DH),参与滞育激素信号的转导,在家蚕滞育发动过程中发挥重要作用。采用RT-PCR方法克隆出BmDHRcDNA,其开放阅读框长1 311 bp,编码436个氨基酸,属于一种G蛋白偶联受体,含有7个跨膜结构域。同源性及系统进化分析表明,BmDHR蛋白序列与玉米夜蛾性信息素合成激活肽受体(HzPBANR)和家蚕性信息素合成激活肽受体(BmPBANR)蛋白序列具有较高的同源性,分别为46.0%和40.9%。定时半定量分析显示,BmDHR基因表达水平在不同条件催青的二化性5龄幼虫、蛹体中存在差异。     

家蚕多梳蛋白家族基因BmPsc的全长序列克隆及表达分析

多梳蛋白(polycomb group,PcG)基因Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)与人类造血干细胞以及多种肿瘤干细胞的维护相关,Bmi-1蛋白具有典型的N端Ring结构,通过结合核小体并抑制其重塑以实现抑制关键基因转录,具有沉默目的基因的功能。Bmi-1在昆虫中的同源基因为Psc(posterior sex combs)。采用RACE技术获得家蚕Psc基因(BmPsc)全长4 084 bp的序列。该基因位于家蚕第4号染色体上,是一个单外显子基因,ORF为3 291 bp,编码1 096个氨基酸,蛋白质分子质量121 kD,等电点(pI)为9.83;同源序列比对发现BmPsc与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的Psc基因序列有58%的相似度,与果蝇(Drosophila melanogaster)的Psc基因序列仅有34%的相似度;氨基酸序列分析显示BmPsc具有保守的N端Ring结构。利用qRT-PCR检测家蚕5龄第3天幼虫各组织以及5龄各时期幼虫血液中BmPsc基因的表达水平,发现BmPsc在各组织均有表达,在精巢以及卵巢中的表达明显较高,其次是翅原基(含造血器官),在循环血液中也有较高表达;在5龄各时期幼虫血液中的表达呈一定规律性,于蜕皮后的5龄第2天以及进入变态前的5龄第6天出现表达峰值,而在5龄中期(第4～5天)为表达低谷。研究结果为进一步阐释该基因在细胞水平以及个体水平对干细胞分化的抑制作用奠定了基础。     

从云南省地方黄茧品种B黄2克隆的类胡萝卜素结合蛋白基因的cDNA序列分析

类胡萝卜素结合蛋白(CBP)是家蚕黄茧形成的关键因子。利用RT-PCR方法从云南省地方黄茧品种B黄2的5龄幼虫丝腺中克隆了编码CBP的基因cDNA序列。序列及同源性分析表明,克隆的CBP基因cDNA序列全长898bp,编码297个氨基酸残基组成的蛋白,该序列与从日本黄茧品种N4的丝腺中克隆的编码CBP的基因(GenBank登录号:AB062740)序列相似性为100%。生物信息学分析表明该序列编码的CBP蛋白为非分泌型蛋白,且定位于细胞质中的可能性最大。研究结果显示云南黄茧品种B黄2与日本黄茧品种N4的CBP基因CDS序列完全一致,编码蛋白也一样,证明黄茧品种B黄2的茧色不同于N4的茧色,并非是由CBP基因序列产生变异位点导致的,色彩的差异可能是受到黄茧系其它茧色形成因素的影响。     

家蚕Bmtdh基因的克隆与序列分析

克隆了家蚕苏氨酸脱氢酶基因(Bmtdh),其cDNA长1 310 bp(No.ABA43639.1),包括227 bp 5′-UTR和1 026 bp的完整开放读码框(ORF)。Bmtdh在家蚕基因组上以单拷贝形式存在,编码342个氨基酸,其Ile29-Val322区域是一个完整的表面异构酶功能域。表达谱分析与EST数据的分析表明,Bmtdh在丝腺和卵巢中的转录水平高于其它组织,并且Bmtdh在家蚕4龄眠期、5龄早期的转录水平也很高,而在卵期(G2胚胎)和1龄早期没有检测到其转录表达,表明Bmtdh基因可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。     

Identification of two allelic forms of ovine CD4 exhibiting a Ser183/Pro183 polymorphism in the coding sequence of domain 3

The ovine CD4 cDNA sequence from four sheep sources (Australian Merino, Indonesian Thin Tail, Canadian cross bred, Prealpes du sud) predicts a protein of 455 residues with position 130 in the V2 domain exhibiting a W instead of C suggesting that, like the white whale, dog and cat sequences, sheep CD4 contains only two disulphide bonds. The sequence shows 73% amino acid identity and 83% nucleotide identity to a CD4 sequence from the white whale and significant identity to a partial sequence (314 residues) of bovine CD4 (87% amino acid identity, 93% nucleotide identity). Phylogenetic analysis showed that the ovine CD4 sequence forms a clade with the pig, white whale, dolphin, dog and cat CD4. Two forms of ovine CD4 were identified which differ by a single base pair (T/C) in their cDNA sequence at position 622. This polymorphism is also present in sheep genomic DNA in Hardy-Weinberg equilibrium, suggesting that at least two alleles of CD4 exist in the ovine genome with no selection for a particular allele. This polymorphism changes the first codon position of amino acid 183 and results in a Pro/Ser substitution in the N-terminal region of domain 3 of the CD4 protein.     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

家蚕细胞色素P450基因CYP9A22的克隆及在中肠和脂肪体的诱导转录

细胞色素P450对昆虫的生长发育、环境适应性以及抗药性具有重要作用。为了探讨氯氰菊酯对家蚕(Bombyxmori)细胞色素P450基因转录的诱导作用,采用RT-PCR技术和cDNA末端快速扩增(RACE)策略,从家蚕5龄幼虫克隆到细胞色素P450基因CYP9A22(GenBank登录号:EF535804)。CYP9A22基因的cDNA编码区长1 596 bp,编码531个氨基酸,推定的蛋白质分子质量为61 kD,等电点为7.71。将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,有9个内含子;与已知的CYP9家族的棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP9A14基因的相应氨基酸同源性达到62.3%。用半定量RT-PCR方法分析氯氰菊酯诱导家蚕CYP9A22表达水平,结果表明:CYP9A22的mRNA转录表达具有组织特异性,在中肠的表达量高于脂肪体;氯氰菊酯诱导家蚕24 h,在其脂肪体的表达量是未诱导家蚕脂肪体的3.1倍,初步推测CYP9A22的过量表达可能与抗药性有一定关系。     

白颖苔草热激转录因子基因的克隆及其序列分析

白颖苔草(Carex rigescens(Franch.)V.Krecz.)的热激转录因子基因是重要的耐热候选基因。通过序列多重比对设计简并引物,扩增出白颖苔草的热击转录因子基因cDNA的中间片断,并在此基础上利用RACE技术得到3′端cDNA片段和5′端cDNA片段。结果表明:通过序列拼接获得该基因的全长cDNA(1226bp),命名为CrHSF。序列分析表明其含有一个完整的开放阅读框(103～1023bp),编码蛋白质含有306个氨基酸,分子量为38.75kDa,等电点为5.85。CrHSF的氨基酸序列与OsHSF的同源性为59%,与已知的其他热激转录因子也具有较高的同源性。在CrHSF的氨基酸序列中没有预测到信号肽以及跨膜区域,但是具有多种翻译后修饰的加工位点。     

野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶基因的克隆分析与原核表达

超氧化物歧化酶是野桑蚕保护酶体系的重要酶类。利用RT-PCR方法克隆出野桑蚕铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)cDNA(EMB I登陆号:AM410997),其开放阅读框ORF长465 bp,编码154个氨基酸。同源性及系统进化分析表明,推导出的氨基酸序列与3种果蝇的同源性平均为69.3%,与线虫为57%,各物种中与Cu/Zn结合的残基高度保守。利用ExPASy的ScanProsite以及PSort和TMpred对此编码的蛋白质结构和功能域分析,预测出其具有2段Cu/Zn-SOD特异序列,且该蛋白不存在信号肽以及跨膜区。将Cu/Zn-SOD cDNA克隆到pET-28 a(+)表达载体,测序鉴定后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳鉴定其表达的融合蛋白质分子量为19.4 kD。     

家蚕Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因BmSPI3的克隆与表达特征分析

Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(SPI)在机体的发育、免疫等生理过程中发挥重要的作用。从家蚕蛹cDNA文库中获得一条全长为728bp的基因序列,对该基因编码的氨基酸序列进行同源性比对,发现其蛋白具有保守的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域(CⅠ-X3-CⅡ-X8-CⅢ-X14-CⅣ-X6-CⅤ-X13-CⅥ),且P1活性位点为赖氨酸(K),因此将该基因命名为BmSPI3(Gen-Bank登录号:DN237641)。通过PCR扩增BmSPI3基因,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后成功构建了重组表达质粒pGEX-4T-1-BmSPI3,并转化到E.coliBL21(DE3)表达,经SDS-PAGE电泳检测在约36kD处有明显的蛋白表达条带。提取各发育时期蚕体和5龄幼虫各个组织的总RNA进行荧光定量PCR,检测结果表明:BmSPI3在5龄幼虫期表达量最高,卵期最低;在5龄幼虫表皮中的表达量最高,在马氏管的表达量最低。推测BmSPI3对胰蛋白酶和类胰蛋白酶具有抑制作用。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。