多重PCR同时检测猪圆环病毒2型,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒

本试验建立一种可同时检测猪圆环病毒2型(PCV-2),猪细小病毒(PPV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪瘟病毒(CSFV)4种病毒的多重PCR方法.对于每一种特定的病毒,用4对寡核苷酸引物均能特异扩增其目的片段.以含有病毒目的片段的质粒为模板,测定了多重PCR的检测灵敏度,PRRSV和CSFV检测最低限是48 pg,而PPV和PCV-2为0.48 pg.利用建立的多重PCR方法对具有产自有繁殖障碍母猪的仔猪或具有呼吸障碍症状的76个仔猪样本进行检测.检出了4种病毒的存在,其中26个样本(34.2%)同时感染了2种以上病毒.结果表明多重PCR方法检测猪混合感染的病毒,是一种快速、灵敏、低成本、高效率的病原学诊断工具.     

猪瘟猪繁殖与呼吸综合征猪圆环病毒2型混合感染

2005年底江苏某猪场饲养的商品肉猪群中部分猪只陆续发生高热、皮肤发绀、呼吸困难等症状，病程一般持续5～7天，发病猪一般以死亡为转归，发病猪在濒死前发生全身抽搐等神经症状。不同年龄段的猪群中均有不同程度的发生，临床表现基本相似。通过临床病理剖检和实验室诊断相结合的方法，诊断为猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征，猪圆环病毒2型混合感染。     

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型的混合感染

2005年以来,贵州省一些猪场发生以母猪流产、产弱仔、死胎,仔猪腹泻、消瘦、行动障碍等为特征的疾病,剖检病猪可见心肌、肾、淋巴结等出血,肺水肿,肝脏表面有灰白色坏死点,脾脏边缘有出血性梗死,发病率和死亡率较高。运用荧光抗体技术检测猪瘟（CSF）,设计套式引物用RT PCR或PCR方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV-2),并进行了细菌分离培养。综合临床症状、病理变化、实验室检验,确诊为猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒2型（PCV-2）混合感染。     

猪瘟合并猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染

2004年初以来，杭州地区的几个规模化猪场陆续发生仔猪腹泻、保育猪呼吸困难的疾病，剖检见肺部呈橡皮样，全身淋巴结水肿，部分猪脾脏边缘梗死等，发病率、死亡率较高。设计针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的特异性引物，进行RT—PCR或PCR检测；运用伪狂犬病（PR）鉴别试剂盒检测PR，运用免疫荧光法检测猪瘟（HC），并进行了细菌分离培养，通过全面检查认为，这几个猪场发生了猪瘟合并猪PRRSV、PCV2感染。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染研究进展

1病原简介 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，以母猪的繁殖障碍、哺乳仔猪的高死亡率及呼吸症状为特征的一种传染病。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。该病1987年在美国首先发生，随后在世界各主要养猪国家流行。按其遗传差异和抗原性差异，可分为欧洲型（A群）与美洲型（B群）。该病毒的基因组全长约为15kb，含有8个开放阅读框架（ORFs），其中ORF1a和ORF1b编码病毒非结构蛋白，ORF2-ORF7编码病毒的结构蛋白。我国1996年由郭宝清等首次报道该病，研究证明其为美洲型。PRRS在我国大部分地区均有流行，造成巨大的经济损失。     

华南地区猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测分析

为了解华南地区猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒的最新流行情况,采集了华南地区11个规模猪场各饲养阶段猪血清807份,用套式PCR(nPCR)检测猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2);采集了若干猪场2010年1月至2011年8月期间有咳嗽、喘气、消瘦及疑似PDNS等临床症状的猪血清312份,以及无临床症状猪血清104份,以nPCR检测PCV-2,以一步法反转录PCR(RT-PCR)检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。结果发现,所调查的11个规模猪场中只有5个检出PCV-1,所有猪场均检出PCV-2。PCV-2阳性率为30.61%,而PCV-1阳性率仅为4.21%;经产母猪和7周龄以上保育猪PCV阳性率最高;有临床症状的猪血清PCV-2阳性率为58.65%,PRRSV阳性率为37.82%,PCV-2阳性猪群中有39.89%的猪同时感染PRRSV;有症状猪群7月～9月的PCV-2感染率最高,而1月～3月最低;无临床症状猪血清PCV-2阳性率为27.9%,PRRSV阳性率为0.96%,PCV-2与PRRSV无混合感染。证明PCV尤其是PCV-2在华南地区仍广泛传播并流行,而且PCV-2与PRRSV混合感染致病情况较多。PCV-2的感染率与季节有一定的相关性,种猪带毒情况严重。     

同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒的多重PCR技术

本试验设计了一种多重聚合酶链反应（PCR）技术,可用于同时检测与猪繁殖和呼吸衰竭相关的3种病毒一猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒2型（PCV2）。根据3种病毒的靶序列设计引物,     

应用PCR检测猪圆环病毒2型和猪繁殖呼吸综合征混合感染

猪圆环病毒病自1991年加拿大首次报道以来，包括我国在内的世界上许多国家和地区都报道有该病发生。近年来，该病发生呈上升趋势，给世界的养猪业造成了相当大的经济损失。目前猪圆环病毒在猪场中的感染率是很高的，它主要侵害断奶后2-3周的仔猪，发病率为20％。60％，死亡率为5％-35％。已成为阻碍当今养猪业发展的重要病原之一。     

混合感染猪繁殖与呼吸综合征和圆环病毒2型猪群的猪瘟抗体变化研究

本试验研究旨在探究猪场发生猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)与圆环病毒2型(PCV2)混合感染后,猪群的猪瘟抗体变化,运用RT-PCR、实时荧光RT-PCR与PCR方法,对四川某规模化发病猪场进行高致病性PRRS、猪瘟与圆环2型的病原检测。结果显示高致病性PRRS、圆环2型和猪瘟阳性率分别为54%(19/35)、50%(17/34)、0(0/5)。结合临床症状、病猪剖检变化,确诊为PRRSV与PCV-2混合感染。采集PRRS与PCV-2混合感染病猪血清12份为试验组,本场健康猪只(无临床症状、抗原检测阴性)12份为对照组,运用ELISA试验检测猪群猪瘟抗体,结果显示试验组的猪瘟抗体合格率为33%(4/12),显著低于健康对照组的合格率83.3%(10/12)(P0.05),结果表明PRRS和PCV2混合感染会对猪瘟抗体产生负面影响。     

猪圆环病毒-Ⅱ型、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及初步应用

针对猪圆环病毒-Ⅱ型(porcine circovirus typeⅡ,PCV-Ⅱ)、猪瘟病毒(swine fever virus, CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)的保守区域设计用于构建荧光定量PCR体系的引物和探针。以构建的重组质粒标准品为模板建立三重荧光定量PCR体系,并对三重荧光定量PCR体系进行优化和特异性检测、灵敏性检测、重复性试验、标准曲线制作。最后利用构建的三重荧光定量PCR体系和普通PCR体系同时进行临床检测,并对两者的检测结果进行对比。结果显示,3种病毒在单重和三重荧光定量PCR体系中均无非特异性扩增;3种病毒在单重和三重荧光定量PCR体系中的灵敏度均可达到10拷贝/μL;单重和三重荧光定量PCR体系组内和组间重复性变异系数均在5%以内;单重和三重荧光定量PCR在稀释度范围内呈现良好的线性关系。应用本研究构建的三重荧光定量PCR体系对106份临床组织样品进行检测,其中PCV-Ⅱ阳性检出率为74.5%,CSFV阳性检出率为34.9%,PRRSV阳性...     

猪瘟、猪圆环病毒病和猪繁殖与呼吸综合征寡核苷酸芯片诊断方法的建立与初步应用

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）是引发猪繁殖障碍的主要病原,建立其基因芯片快速检测体系,对开发猪繁殖障碍快速检测试剂盒具有重要意义。根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因组序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。通过引物标记及特异性验证,建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核苷酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。     

捷申病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测猪捷申病毒(PTV)、猪瘟病毒(csFv)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSV)的多重RT-PCR (mRT-PCR)检测方法,本研究以PRRSV ORF6基因、CSFV Ems基因和PTV 5＇-UTR基因为对象,建立检测3种病毒的mRT-PCR方法.特异性试验表明,该方法可以特异扩增3种病毒的基因,对大肠杆菌、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪流感病毒呈阴性反应;敏感性试验表明,PRRSV、CSFV和PTV的最低核酸检出量分别为7.11×102拷贝、7.81×103拷贝和8.43×102拷贝,略低于单一RT-PCR敏感性;应用该方法对69份送检样品进行检测,其中PRRSV、CSFV和PTV单纯感染检出率分别为28.99％、27.54％和56.52％,PRRSV和CSFV混合感染检出率为4.35％,PRRSV和PTV的混合感染检出率为11.59％,CSFV和PTV的混合感染检出率为13.04％,3种病毒的混合感染检出率为8.70％,与单一RT-PCR检测结果符合率为98.6％.本研究建立的检测方法快速简便,可以用于疾病的初步筛选,对临床早期诊断和流行病学调查具有重要意义.     

表达猪瘟病毒E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒的研究

为构建表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白重组猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV),本研究首先利用高致病性PRRSV弱毒疫苗HuN4-F112株的感染性分子克隆作为平台,构建了一个在nsp2区有缺失的感染性分子克隆,命名为pHuN4-F112-△480-620。以pHuN4-F112-△480-620作为载体,采用突变PCR的方法将CSFV的主要保护性抗原E2基因1 bp～9 99 bp,1 bp～600 bp,1 bp～330 bp及256 bp～330 bp基因片段分别插到nsp2中aa 480～aa 620位氨基酸缺失编码区域。结果显示,插入完整E2基因或较大E2基因片段的重组PRRSV cDNA质粒均未能拯救出病毒,只有插入较小的E2基因片段(256 bp～330 bp)的重组病毒cDNA质粒成功地拯救出了重组病毒rPRRSV-F112-E2(256-330),拯救的病毒能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,而且生长速度明显高于其亲本病毒,间接荧光检测表明该重组病毒能够表达外源基因。     

Porcine circovirus type 2 decreases the infection and replication of attenuated classical swine fever virus in porcine alveolar macrophages

Recently, it has been noted that porcine circovirus type 2 (PCV2) infection adversely affects the protective efficacy of Lapinized Philippines Coronel (LPC) vaccine, an attenuated strain of classical swine fever virus (CSFV), in pigs. In order to investigate the possible mechanisms of the PCV2-derived interference, an in vitro model was established to study the interaction of LPC virus (LPCV) and PCV2 in porcine alveolar macrophages (AMs). The results showed that PCV2 reduced the LPCV infection in AMs and the levels of PCV2-derived interference were dose-dependent. The PCV2-derived interference also reduced the replication level of LPCV in AMs. The full-length PCV2 DNA and its fragment DNA C9 CpG-ODN were involved in the reduction of LPCV infection in AMs, whereas UV-inactivated PCV2 was not. In addition, a moderate negative correlation between the LPCV antigen-containing rate and IFN-γ production was observed, and had a dose-dependent trend with the level of PCV2-inoculation. The results of the present study may partially explain how PCV2 infection interferes with the efficacy of LPC vaccine.     

猪瘟病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立及其初步应用

针对CSFV基因组5＇端非编码区序列设计并合成了高度特异的一对引物和一条探针,用于猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立。将提取的病毒的总RNA做为模板进行反转录和PCR,将PCR产物克隆到pMDl8-T载体后进行大肠杆菌转化,提取阳性质粒做为标准品绘制标准曲线,成功地建立了特异性检测CSFV的荧光定量RT-PCR方...     

种公猪精液中猪瘟和蓝耳病病毒混合感染的快速检测

参考GenBank公布的猪蓝耳病病毒(PRRSV)VL2332株、LV株以及猪瘟兔化弱毒(CSFV)C株的基因序列,各设计合成了一对引物,建立了在相同PCR扩增条件下能同时检测PRRSV和CSFV的RT-PCR方法。对2003~2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的17个大中型猪场送检的186份种公猪精液进行了检测,结果18份呈PRRSV阳性,24份呈CSFV阳性,其中有11份为PRRSV和CSFV的混合感染,约占送检精液样品的5.91%。试验结果表明,所建立的RT-PCR方法可用于精液中这2种野毒感染的快速鉴定和分子流行病学调查。     

食源性动物组织中CSFV和PRRSV双重双色荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检检测食源性动物组织中猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量RT-PCR方法。本研究根据SCFV和PRRSV基因序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针,通过优化反应的体系和扩增条件,建立了能够检测食源性动物组织中SCFV和PRRSV的双重双色荧光定量PCR的方法。其检测下限为1×102拷贝/μL,而且与其他一些猪病病毒无交叉反应,具有良好的特异性。该方法重复性和稳定性试验表明其组内和组间的变异系数最高分别为4.2和4.5。对比试验表明,该方法对CSFV和PRRSV检验的敏感性为常规RT-PCR方法的200倍;该方法的建立为食源性动物组织中CSFV和PRRSV提供了有效手段,该方法特异性和敏感性较好,能够应用于临床检测。