托鲁巴姆嫁接苏畸茄高产栽培技术

在皖江流域,茄子黄萎病是茄子生产中的一种毁灭性的病害,轻则减产,重则绝收.我们在多年实践中,总结出一套以抗病毒砧木进行嫁接为主要技术手段的防治茄子黄萎病等病害而获得高产的栽培管理技术,亩产量达到 7 500 kg,取得了较好的经济效益.     

化学物质对野生茄子托鲁巴姆种子萌发的影响

试验用浓度为500～2000mg/L的赤霉素（GA3）、0.5%～5.0%的KNO3、0.1%～1.0%的NaNO3和20%～30%的PEG对托鲁巴姆种子进行不同时间浸种处理,以研究其对种子萌发的影响,结果表明：500～2000mg/L GA3浸种处理对托鲁巴姆种子的萌发有极显著的促进作用,随着GA3处理浓度的升高,托鲁巴姆种子的发芽率、发芽势、发芽指数显著提高,其中以1000～2000mg/L GA3浸种36h的处理效果最佳,种子发芽率、发芽指数和发芽势比对照提高了27.39%～69.27%、195.33%～234.70%、1662.50%～1493.75%,与对照差异达极显著水平。处理后的托鲁巴姆种子9d即可完成萌发,而对照需14d,大大缩短了催芽时间,发芽也较整齐,是参试处理中较好的类型。PEG在低浓度下（20%）对托鲁巴姆种子萌发的促进作用最大,与对照差异均达显著水平,随着处理浓度的升高促进作用开始下降,PEG浓度达到40%时抑制托鲁巴姆种子的萌发。0.5%的低浓度KNO3处理能促进托鲁巴姆种子的萌发,种子发芽率、发芽指数和发芽势比对照提高了53.63%、77.56%和185.71%,且差异达极显著水平。而随着KNO3溶液浓度的增加,种子发芽率、发芽指数和发芽势均有不同程度的降低,达到高浓度后表现出抑制作用。NaNO3溶液浸种处理对其发芽势、发芽率和发芽指数没有明显的影响。     

毛白杨巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA的克隆及序列分析

为了发掘我国乡土树种毛白杨巯基蛋白酶抑制剂(CPI)基因资源,该研究在对已知植物巯基蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守性和杨树表达序列标签(EST)序列分析的基础上,设计了1对简并引物和1对杨树特异性CPI引物,应用RT-PCR技术在毛白杨形成层中扩增出了一个696 bp的cDNA片段,将此片段连接到pGEM-T Easy载体上并测序.结果表明,该片段含有一个417 bp的开放阅读框,编码138个氨基酸残基.进一步对氨基酸序列分析表明,该氨基酸具有典型植物巯基蛋白酶抑制剂的保守区段,即靠近氨基端具有甘氨酸（G）残基和［LVI］-［AGT］-［RKE］-［FY］-［AS］-［VI］-［EDQV］-［HYFQ］序列,羧基端具有与酶活性有关的QXVXG结构和PW残基,说明毛白杨形成层中存在CPI基因并能够有效表达.氨基酸序列同源性分析表明,该基因与其他林木CPI的同源性在47%～68%之间.      

托鲁巴姆砧木与番茄嫁接栽培技术

为了解决温室番茄栽培上存在的土传病害和低温障碍引起生理病害发生的问题,辽宁省盘锦市土肥工作站和大洼县田家镇蔬菜技术推广站依据刺茄、托鲁巴姆与番茄同属茄科,根系发达,抗病性及抗逆性强,生产上已普遍用作茄子嫁接砧木,选择刺茄、托鲁巴姆作砧木,与番茄L402嫁接.     

大豆蛋白酶抑制剂基因的克隆及生物信息学分析

为了研究使用安全的抗虫蛋白,以市售吉育47种子为材料,利用RT-PCR方法,从大豆吉育47萌发种子提取RNA,以该RNA为模板进行反转录并进行PCR,扩增大豆吉育47蛋白酶抑制剂基因并进行生物信息学分析与表达载体的构建。结果表明:克隆到长252bp的完整编码基因序列,编码84个氨基酸残基;经测序与同源比对鉴定该基因与已报道基因相似性高度一致;以pCAMBIA3301为基础构建了植物表达载体pCAMBIA3301PI并转化入农杆菌EHA105中。     

菜青虫胰凝乳蛋白酶基因PrCT1的克隆及表达分析

胰凝乳蛋白酶是昆虫的主要消化酶,可能参与多种消化以外的生理过程。为了解该蛋白质基因表达特性,基于菜青虫(Pieris rapae)转录组数据,克隆了1个菜青虫胰凝乳蛋白酶基因PrCT1并进行相关分析。该基因编码区全长861 bp,编码286个氨基酸,含有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体(H_(57)、D_(102)、S_(195)),经丝氨酸蛋白酶底物特异性口袋分析,显示其属于胰凝乳蛋白酶。PrCT1与黑脉金斑蝶胰凝乳蛋白酶(GenBank登录号:OWR53227)同源性最高,达到49%,且亲缘关系最近。构建pET28a-PrCT1原核表达重组载体,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株进行原核诱导表达。结果发现,重组PrCT1蛋白以包涵体形式存在,分子质量为33.26 ku。利用实时荧光定量PCR检测菜青虫不同组织中PrCT1 mRNA表达及饥饿、决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后PrCT1 mRNA的表达情况显示,PrCT1基因主要在菜青虫的中肠中表达,且在饥饿、决明胰蛋白酶抑制剂喂食处理后表达水平均下调,推测PrCT1可能是菜青虫中肠中发挥食物消化作用的重要蛋白酶,且可能是重要的抗虫靶点。     

赤霉素对茄子砧木托鲁巴姆种子萌发的影响

为研究赤霉素不同浓度和处理时间对茄子砧木托鲁巴姆种子萌发的影响,用300～1 000 mg/kg的赤霉素对托鲁巴姆种子在常温下进行浸种处理试验。结果表明:赤霉素处理后的种子萌发均有明显提高,其中浓度为700 mg/kg、浸种时间48 h处理发芽势、发芽率、发芽指数最好,分别比清水对照高79.4%、92.5%、58.3%。     

赤霉素浸种和催芽对茄子托鲁巴姆种子发芽的影响

托鲁巴姆是目前抗性较好的茄子砧木之一,用常用的育苗技术出芽缓慢。试验结果表明,托鲁巴姆适宜的赤霉素浸种浓度为500 mg·kg^-1,浸种时间为48 h。适宜的赤霉素浓度和浸种时间处理后,在常温、恒温（30℃）、变温（30℃12 h,20℃12 h）3种条件下对托鲁巴姆种子进行催芽,结果4月份的常温条件下催芽,其发芽率最高。     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

干热处理对茄子砧木托鲁巴姆种子发芽力的影响

在60、70℃两种温度条件下进行了托鲁巴姆种子干热处理试验，结果表明，托鲁巴姆种子干热处理的适宜温度为60℃、时间为24～48h，其平均发芽势较对照提高8．1百分点，平均发芽率较对照提高4．9百分点。     

番茄嫁接优良砧木——托鲁巴姆

永定县2002年开始进行托鲁巴姆作砧木进行嫁接栽培试验研究，经多年的试验和推广，摸索一套番茄嫁接栽培的可行技术措施。在推广运用中取得较明显的经济效益．露地栽培采收期可延长130天以上，亩鲜果可达5～6吨，产值达10000～12000元。托鲁巴姆来源于日本．植株高可达2．5米，茎上有少量的刺，种粒较小，千粒重约1克，     

野生茄转化酶抑制子基因 StINH1的克隆与序列分析

以1个受黄萎病菌诱导的“托鲁巴姆”下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄“托鲁巴姆”转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为 StINH1。该基因的开放阅读框全长531 bp,编码176个氨基酸,与电子克隆获得的序列完全相同。编码蛋白的分子质量为19.916 ku,理论等电点为5.14。序列分析表明,该基因属于植物PMEI超家族,编码的前体蛋白含有1个拥有19个氨基酸的前导肽,同时含有多个磷酸化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后, StINH1在“托鲁巴姆”根中呈下调表达。     

无核荔枝半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及序列分析

[目的]对无核荔枝的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因进行克隆,并对其序列下进行分析。[方法]根据构建的无核荔枝胚败育SSH消减文库的半胱氨酸蛋白酶抑制剂EST序列,通过RACE技术获得半胱氨酸蛋白酶抑制基因的核苷酸序列并应用生物信息学软件进行分析。[结果]获得一个635 bp的半胱氨酸蛋白酶抑制基因序列,预测该序列含有321 bp的开放阅读框,推导其编码的蛋白质含106个氨基酸,具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂保守区,与多个物种的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因具有较高的同源性。[结论]为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。     

野生茄子托鲁巴姆StLTPa7的克隆与分析

【目的】从野生茄子托鲁巴姆（Solanum torvum Swartz）中克隆非特异性脂质转移蛋白基因StLTPa7 cDNA,并解析其功能。【方法】采用同源基因设计引物,并根据RT-PCR方法克隆StLTPa7 cDNA序列;通过农杆菌浸染法转化烟草,构建StLTPa7过表达转基因烟草植株;采用菌丝生长速率法检测转基因烟草植株蛋白提取物对大丽轮枝菌的体外抑菌活性。【结果】托鲁巴姆中克隆获得1个StLTPa7 cDNA序列,该序列含有1个345 bp的开放阅读框,推测编码长114个氨基酸的蛋白,相对分子量为11.42 kD,理论等电点为9.01。StLTPa7受水杨酸（SA）和大丽轮枝菌诱导表达,在处理后24和48 h的表达量较高。为了分析StLTPa7对大丽轮枝菌的抗性,构建了过表达转基因烟草植株,共获得了4个PCR阳性转StLTPa7烟草株系。荧光定量PCR分析显示,该基因在转基因烟草株系L5和L7中过量表达。抑菌试验显示,转基因烟草株系L5蛋白提取物对大丽轮枝菌的抑菌率约为对照的2.5倍。【结论】从野生茄子托鲁巴姆中克隆到1个StLTPa7 cDNA序列,该基因与大丽轮枝菌的生长和增殖的抑制作用相关,可能参与植物对大丽轮枝菌的防卫过程。     

不同来源托鲁巴姆种子的发芽特性研究

野生茄子托鲁巴姆(Solanum torvum)是目前应用最广泛的茄子砧木品种。针对当前种子市场上托鲁巴姆供货渠道多、种子质量参差不齐等问题,以10份不同来源的托鲁巴姆种子为材料,研究GA₃浓度及GA₃浸种时间对种子发芽势、发芽率及发芽指数的影响。试验结果显示,在未经GA₃处理的条件下,不同来源的托鲁巴姆种子发芽势、发芽率存在显著差异,其中仅2份托鲁巴姆种子的发芽率达到90%以上。托鲁巴姆种子来源、GA₃浓度对种子发芽率、发芽指数存在极显著影响,GA₃浸种时间对种子发芽指数存在极显著影响。在种子发芽率方面,种子来源×GA₃浓度、GA₃浓度×GA₃浸种时间以及种子来源×GA₃浓度×GA₃浸种时间的互作效应达到显著或极显著水平;而在种子发芽指数方面,种子来源、GA₃浓度、GA₃浸种时间之间的一级互作、二级互作均达到极显著水平。表明不同来源的托鲁巴姆种子适宜采用不同的GA₃浓度和GA₃浸种时间,以达到最佳的种子发芽效果。试验结果还表明,在购买的10份托鲁巴姆种子中,有9份发芽率未达到种子包装袋标识的发芽率水平。     

慈姑蛋白酶抑制剂基因转化小白菜获抗虫转基因植株

通过根癌农杆菌的介导将慈姑蛋白酶抑制剂基因导入小白菜。Ｋａｎａｍｙｃｉｎ筛选浓度为１０－１５ｍｇ．Ｌ＾－１,抑制农杆菌生长的抗生素选用Ｃ浓度为３００－５００ｍｇ．Ｌ＾－１。小白菜带柄子叶被农杆菌感染后,抗性芽的诱导频率为０．２％－２．０％。加入适量的ＡｇＮＯ３不仅可以抑制过度生长的农杆菌,还可以使抗性芽的诱导频率约提高到５％。试验获得转基因植株９７株。     

大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达

OmpT(Outer-membrane proteases T)是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。利用大肠杆菌OmpT降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽,可以为开发抗OmpT蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT的基因序列设计一对引物,应用聚合酶链式反应(PCR)方法,从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954 bp的序列,测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99.99%。将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-OmpT。经IPTG诱导后,在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36 kDa且具有生物活性的OmpT蛋白。生长曲线试验显示,抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT的大肠杆菌生长没有影响,而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。     

蒙古沙冬青胰蛋白酶抑制剂基因AmTI的克隆及其功能分析

蛋白酶抑制剂(Protein inhibitors,PIs)是一类小分子多肽或蛋白质,在植物抵抗生物和非生物逆境中起中起重要作用.利用PCR方法从强抗逆植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)中克隆到一个胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitors,TI8)基因AmT7,分析了其在非生物胁迫下的表达变化,构建了其植物表达载体.结果表明,AmTI的编码蛋白含197个氨基酸残基,分子质量为21.5kDa,在N端有信号肽序列,属于Kunitz型;在正常生长条件下,该基因只有微量的基础表达,但在脱水、低温和盐胁迫处理下,其表达量显著上调.本研究为进一步揭示AmTI的功能奠定了基础.     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

蛋白酶抑制剂与植物非生物胁迫抗性关系研究进展

蛋白酶抑制剂在广泛存在于植物组织中,对于植物抵抗生物胁迫有着重要的作用。研究发现蛋白酶抑制剂在植物非生物胁迫抗性方面的提高也有着作用,综述了蛋白酶抑制剂在提高植物非生物胁迫抗性,如盐、干旱、温度和氧化胁迫等方面的进展,并探讨了其作用的机理可能是通过各种方式增强某些蛋白的功能,进而消除各种非生物胁迫引起的氧化胁迫。