抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

奶山羊细菌人工染色体基因文库构建的初步研究

细菌人工染色体(BAC)文库是进行动物基因组学研究的一个重要手段,为配合山羊乳腺生物反应器的研究,对构建山羊基因组BAC文库进行了初步研究。用H indⅢ酶对莎能奶山羊基因组进行部分酶切,用CHEF(箝位匀强电场)二次电泳法回收150 kb大小条带,电透析回收高分子量(HMW)DNA;同时以BAC载体pB eloBAC 11为材料,分别采用限制性内切酶H indⅢ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,将该载体自连并通过凝胶回收线性段DNA,获得了可用于构建BAC文库的线性载体。将HMW与载体进行连接,电击转化感受态DH 10β大肠杆菌,一次转化得到近2 000个克隆。插入片段大小为50~200 kb,基本满足建库的需要。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

关中奶山羊BAC文库构建条件研究

BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。     

脉冲场凝胶电泳在BAC文库插入片段分析中的应用

脉冲场凝胶电泳作为一种分离大片段DNA的方法,在基因组文库的构建及其文库鉴定中是不可缺少的实验技术。利用脉冲场凝胶电泳对已构建好的BAC文库进行了插入片段大小分析,结果显示:利用脉冲场凝胶电泳分析后,文库的平均插入片段大小为133Kb,符合文库的要求。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

[目的]简便有效地解决BAC载体序列因单一拷贝数带来的制备以及下游亚克隆操作的困难。[方法]选择适当的单一酶切位点,将单拷贝BAC载体质粒序列全部插入高拷贝质粒pUC119载体的适当位点。[结果]BAC载体基本功能基因序列在新质粒pUC119-BAC中失去了单一拷贝数控制功能,以高拷贝形式进行复制,利用单一酶切,可将BAC载体基本功能基因序列完整切下来,自连后重新恢复严格的单拷贝控制功能。[结论]利用高拷贝pUC119-BAC质粒,实现了BAC载体的基本功能基因序列高拷贝的复制和扩增,可以方便地用于分子克隆化重组病毒转移载体的构建或BAC文库的构建。     

芥菜型油菜品种四川黄籽的BAC文库构建与分析

为促进黄籽油菜的基因组研究和利用，构建了芥菜型油菜黄籽品种四川黄籽的高质量BAC文库。该文库由82 944个单克隆组成，被保存在216块384孔板中。质粒酶切检测结果表明，文库的平均插入片段大小约为140 kb，空载率约为2.5%，按照芥菜型油菜基因组1 000 Mb计算，文库覆盖度约为油菜基因组的11.6倍。BAC末端序列比对分析结果显示，克隆被均匀比对到芥菜型油菜的18条染色体上，并且无任何叶绿体、线粒体和细菌基因组DNA污染。     

长片段水稻细菌人工染色体DNA的亚克隆文库的构建

利用超声波振断法将水稻细菌人工染色体 (BAC)基因组文库———Nipponbare库中的一个BAC克隆 (E5 0 )振断 ,产生许多大小不同的DNA随机片段 ,回收其中 1 7～ 3 5kb的片段 ,并将这些随机片段克隆入质粒载体pUC18,构建了适合于鸟枪法测序的亚克隆BAC文库     

大麦BAC文库三维混合池的构建与HvGW2筛选

【目的】从大麦BAC文库中快速筛选包含目的基因HvGW2的阳性BAC克隆。【方法】构建BAC文库三维混合池,设计2对HvGW2特异性引物,进行BAC文库筛选,对含有目的基因HvGW2的阳性BAC克隆进行测序,获得编码大麦GW2蛋白的基因组DNA序列,并与禾本科中的GW2进行同源进化分析。【结果】构建了大麦BAC文库的三维混合池160个,文库空载率为0.18%;筛选到含HvGW2的阳性BAC克隆3个,其中,BAC克隆196M02包含完整编码该基因的序列;HvGW2包含8个外显子和7个内含子,具有与其它植物GW2相似的结构特征和保守的功能结构域;同源进化分析结果显示,大麦与小麦的GW2蛋白同源性最高;序列分析发现,HvGW2第6内含子上包含2个不同类型的反转录转座子插入,从而使大麦比其它作物的GW2长度增加11.5 kb以上。【结论】通过构建三维混合池快速筛选包含目的基因的单个阳性BAC克隆,建立了大麦目标基因克隆的辅助平台;HvGW2基因组中位于内含子区的反转录转座子插入导致基因长度增加,可能是影响该基因转录水平的关键变异。     

毛竹萌发种子全长cDNA文库的构建

[目的]构建毛竹萌发种子的全长cDNA文库。[方法]以毛竹萌发种子为材料,利用Oligo-capping法构建其全长cDNA文库。[结果]试验得到文库的库容达650万克隆,空载较少;插入片段大小在0.3～5.0 kb之间,片段大小的分级严格且一致性良好,其中显著的是长片段全长cDNA(1.0～5.0 kb)的比例高达30%,达到了高质量全长cDNA文库的标准。[结论]毛竹萌发种子全长cDNA文库的成功构建将为竹类植物功能基因组研究奠定重要的前期科研基础。     

广谱拮抗菌B96-II启动子的克隆研究

[目的]构建拮抗菌B96-Ⅱ的启动子文库,为B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记提供试验基础。[方法]提取拮抗菌B96-Ⅱ的基因组DNA,以绿色荧光蛋白基因（gfp）为报告基因,以启动子探针pNW33N-gfp为载体,通过鸟枪法在E.coliDH5α中构建B96-Ⅱ的启动子文库。[结果]通过筛选获得了21个阳性克隆,编号为P1~P21,这些阳性克隆在荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光。研究表明,在热激时间为90 s、用4μl酶连产物原液进行转化时,所得转化子数量最多,平均每平皿可得到167个转化子。[结论]表达绿色荧光蛋白的B96-Ⅱ启动子文库的成功构建为拮抗菌B96-Ⅱ的绿色荧光蛋白标记和环境行为研究奠定了良好的基础。     

稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

Research on the Construction of Bacterial Artificial Chromosome Vector DNA and the Potentials in Application

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法(英文)

[Objective] The aim of this study was to provide a method for solving the problems in preparing BAC vector with High-copy plasmid pUC119-Bluelox BAC.[Method] With selecting a proper single restriction site,sequences of a single copy BAC vector plasmid were inserted into proper site of High-copy plasmid pUC119 vector.[Result] The gene sequence of BAC vector lost control function of single copy number in new plasmid pUC119-BAC and was copied through High-copy form. The gene sequence of BAC vector basic function was completely cutted off through single enzyme digestion and the control function of single copy could be recovered by auto-connection.[Conclusion] The High-copy pUC119-BAC plasmid was used to copy and amplify high copy of basic function gene sequence in BAC vector,besides that it could be used to construct transfer vector of molecular cloned recombinant virus or BAC library.     

温泉土壤宏基因组文库构建及普鲁兰酶筛选

[目的]构建温泉土壤宏基因组文库并进行普鲁兰酶活性筛选,以期获得高活力、耐高温的新型普鲁兰酶基因.[方法]采用间接法提取温泉土壤样品中宏基因组DNA,经Sephadex G200（含2％ PVPP）凝胶柱和电洗脱两步纯化后,扩增16S rRNA序列,通过序列比对和系统发育进化树分析温泉土壤微生物的多样性;然后以pCC1FOS为载体构建温泉土壤宏基因组文库,并对所获得的宏基因组文库进行活性筛选.[结果]利用宏基因组技术提取温泉土壤样品中微生物的基因组DNA,构建了一个约含1 146个克隆的温泉土壤16S rRNA文库,经遗传进化分析,发现温泉土壤样品中的大部分微生物未被研究过,主要来源于厚壁菌门（Firmicutes）,其次为恐球菌—栖热菌门（Deinococcus-Thermus）和变形杆菌门（Proteobacteria）.用提取获得的宏基因组DNA成功构建了温泉土壤微生物宏基因组Fosmid文库,文库约含2.7万个克隆,平均插入片段长度为40.0 kb,文库外源DNA总容量为1.2×10^9bp;通过活性筛选共获得9个可表达普鲁兰酶活性的克隆.[结论]宏基因组文库技术是获取极端环境微生物新酶的有效手段,可为进一步挖掘普鲁兰酶的应用潜力及研究其耐热机理奠定基础.     

合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选

[目的]研究合浦珠母贝微卫星DNA标记的分离与筛选。[方法]采用生物素标记的5个探针,用磁珠富集法构建合浦珠母贝基因组微卫星富集文库,并对文库进行筛选、测序与引物多态性筛选。[结果]对500个克隆进行PCR筛选,测序分析发现130个克隆含有微卫星重复单元。序列比对后最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆,其中包含179个微卫星DNA结构域。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在合浦珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物,其中8对在种群中（n=32）具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0．239～0．787;等位基因数在2～9个;观测杂合度介于0．22～0．56;期望杂合度的变化范围为0．25～0．83。[结论]这研究为进一步开展合浦珠母贝的遗传分析提供了基础资料。     

一种新的获取海洋贝类基因组DNA的取样方法（摘要）

[目的]探讨一种新的获取海洋贝类基因组DNA的取样方法,为开展珍稀贝类的分子生物学研究提供参考。[方法]以文蛤、栉江瑶、翡翠贻贝、香港巨牡蛎、毛蚶为供试材料,以闭壳（合）肌全基因组DNA作为参考,采用常规酚-氯仿法抽提贝类贝腔液基因组DNA,使用生物光度计法、琼脂糖凝胶电泳、目的片段扩增测序验证其质量,并建立系统发育树检测其来源的真实可靠性。[结果]采用常规酚/氯仿基因组DNA提取方法获得的贝腔液DNA质量优于闭壳（合）肌DNA,蛋白质、多酚色素污染较少,完全满足目的片段扩增测序;系统发育进化树则证实了贝腔液并非外源污染。[结论]从贝腔液中获取基因组DNA是完全可行的,并可将其用于目的基因片段的扩增。