稻瘟病菌细菌人工染色体（BAC）基因组文库的构建

 稻瘟病菌是一种重要的植物病原菌,同时又是研究植物和病原物之间相互关系的一个重要试验系统。实验通过采用95-23-4a稻瘟病菌株经提取纯化得到该稻瘟病菌的细胞核基因组总DNA,用限制性内切酶部分酶解后,与经末端去磷酸化处理过的pCUGIBAC1质粒载体按一定摩尔比例相互连接,通过转化E.coli DH10B感受态细胞进而通过蓝白斑筛选挑取白色克隆从而构建了95-23-4a稻瘟病菌株的细菌人工染色体（BAC）基因组文库。通过进行酶切检测及Southern杂交分析后确定所构建的BAC文库平均插入片段29.1 kb,该文库覆盖7.4倍基因组,此基因组文库的构建为该菌致病相关基因的克隆奠定了基础。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建

以P30A细胞质雄性不育系黄化苗为材料,采用蔗糖密度差速离心和不连续蔗糖密度梯度超速离心提取棉花线粒体,低熔点琼脂糖包埋和原位消化裂解的方法制备高分子量的线粒体DNA(mtDNA),经BamHⅠ,HindⅢ酶切和PCR扩增进行纯度鉴定,并对其进行部分酶切,酶切片段与载体连接,电击转入大肠杆菌DH10B中,成功的构建了棉花线粒体基因组BAC文库。该文库共挑取3 840个单克隆,平均插入片段大小为15.5 kb,覆盖率超过70倍,研究结果表明该基因文库具有较高的质量。     

双元细菌人工染色体基因组文库研究进展

酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)是伴随着人类基因组计划的实施而产生的,这些大片段基因克隆载体的应用推动了分子生物学、遗传学等学科的快速发展。以农杆菌介导的直接转化植物为代表的双元细菌人工染色体(BIBAC)载体的发展,加速植物基因组的研究,成为植物基因组分析、基因功能鉴定、染色体结构与功能关系研究的重要工具。介绍了人工染色体文库的发展史,根据建库经验,着重阐述了BIBAC文库的构建、鉴定与应用。     

关中奶山羊BAC文库构建条件研究

BAC(bacterialartificialchromosome,细菌人工染色体)是一种新发展起来的构建高等生物基因组文库的重要方法。由于关中奶山羊产奶性能好,成为制备乳腺生物反应器的理想动物之一,故对关中奶山羊BAC文库的构建条件进行了研究。用BamH 部分酶切关中奶山羊的基因组,用CHEF(箝位匀强电场)凝胶电泳分离大片段DNA,以电透析法回收DNA后,与酶切脱磷的pBeloBAC11载体连接,然后电激转化感受态细胞DH10β,得到了数千个阳性克隆,插入片段平均为30～40kb。在此过程中摸索了BAC载体制备、高分子量DNA制备、酶切、连接和电激转化等一系列环节对高效转化产生大片段DNA克隆的影响。     

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有10⁴个克隆的双元细菌人工染色体（BIBAC）基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。图8参18     

细菌人工染色体文库的构建与鉴定

细菌人工染色体是继γ噬菌体、黏粒、噬菌体人工染色体、酵母人工染色体等载体系统之后发展起来的DNA载体系统,以其容量大、遗传特性稳定、嵌合体少、插入片段易回收、操作简便等优点,而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。因此本文概括性地阐述了细菌人工染色体的发展,以及利用此载体构建基因组文库的机理和程序及其鉴定方法。     

瘤胃元基因组BAC文库研究

目前，传统的分离培养技术在瘤胃微生物的研究中仍存在一些无法逾越的障碍。元基因组文库（metagenomiclibraries）及相关技术的发展，为探讨环境中未培养微生物以及复杂的微生物间关系创立了一个新的平台。将该技术应用于瘤胃微生物研究有着广阔的前景。本文综述了元基因组文库技术在瘤胃微生物研究中的应用潜力，同时介绍了初步应用BAC文库研究瘤胃微生物工作的一些进展。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

黑龙江镜鲤基因组DNA文库的构建

纯化镜鲤体组织的高分子量基因组DNA,经限制性内切酶Sau3A Ⅰ部分消化后,10％-40％蔗糖密度梯度离心分离并回收9—23kb的DNA片段。以λDASHⅡ为克隆载体,与9—23kb的DNA片段进行连接和包装,构建了镜鲤的基因组DNA文库。随机选取5个独立的噬菌斑,提取DNA后用EcoR Ⅰ与BamH Ⅰ进行酶切分析,证明克隆插入率为100％。经测定,该文库的滴度是108pfu/mL,根据公式N=ln(1-P)/In(1-f),99％的镜鲤基因组包含在该基因组文库中。以鲤IGF-Ⅱ基因探针对该基因组文库进行Southem杂交,筛选到相关的阳性克隆,证明这是一个较为完整的镜鲤基因组DNA文库。     

Study on the Mitochondrial Genome of Sea Island Cotton (Gossypium barbadense) by BAC Library Screening

The plant mitochondrial genome displays complex features, particularly in terms of cytoplasmic male sterility （CMS）. Therefore, research on the cotton mitochondrial genome may provide important information for analyzing genome evolution and exploring the molecular mechanism of CMS. In this paper, we present a preliminary study on the mitochondrial genome of sea island cotton （Gossypium barbadense） based on positive clones from the bacterial artificial chromosome （BAC） library. Thirty-five primers designed with the conserved sequences of functional genes and exons of mitochondria were used to screen positive clones in the genome library of the sea island cotton variety called Pima 90-53. Ten BAC clones were obtained and verified for further study. A contig was obtained based on six overlapping clones and subsequently laid out primarily on the mitochondrial genome. One BAC clone, clone 6 harbored with the inserter of approximate 115 kb mtDNA sequence, in which more than 10 primers fragments could be amplified, was sequenced and assembled using the Solexa strategy. Fifteen mitochondrial functional genes were revealed in clone 6 by gene annotation. The characteristics of the syntenic gene/exon of the sequences and RNA editing were preliminarily predicted.     

琯溪蜜柚BAC文库的构建和汁胞粒化相关基因的筛选

【目的】构建琯溪蜜柚BAC文库,利用该文库筛选与汁胞粒化相关的基因。【方法】用温和的物理方法获得高分子量DNA,部分酶切后进行回收、连接、转化,超低温保存阳性克隆。构建DNA样品混合样,PCR法筛选文库,生物信息学分析DNA序列。【结果】改进了适合琯溪蜜柚BAC文库构建的方法;构建的琯溪蜜柚BAC文库含有26112个单克隆,空载率小于1%,叶绿体DNA的污染率不超过1%,插入片段平均大小大约120kb,覆盖8倍的琯溪蜜柚基因组。利用与琯溪蜜柚汁胞粒化相关的EST序列设计PCR引物筛选文库,得到一段大小为1088 bp的DNA序列,该序列含有两段大小分别为122bp和172bp的内含子,经同源比对发现,该序列中部分序列与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)多铜氧化酶(multicopper oxidase)cDNA序列分别有85%和71%的同源性;与毛叶番荔枝(Annona cherimola)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)果胶酯酶(pectinesterase)cDNA序列分别有76%和73%的同源性。【结论】本研究构建的BAC文库适用于琯溪蜜柚功能基因组的研究,从BAC文库筛选获得的DNA序列与汁胞粒化相关的基因有高度同源性。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

基于棉花BAC文库的线粒体DNA的提取方法

以棉花的黄化苗为材料，根据棉花自身的特点，利用差速离心的方法分离线粒体后再经低熔点琼脂糖包埋裂解提取了完整的mtDNA。其质量完全可以满足BAC文库构建中限制性酶切、PCR检测、分子杂交筛选等实验的要求。     

南瓜饮料的研制

以南瓜为原料,研究了南瓜饮料的工艺配方,测定了饮料产品的技术指标。结果表明,南瓜饮料的工艺配方为:南瓜原汁20.000%,香兰素0.005%,甜蜜素0.005%,柠檬酸0.140%,苯甲酸0.015%,0.120%的复合胶(琼脂∶黄原胶=1∶1)。产品具有南瓜原有的橙黄色,无沉淀,具有浓郁的南瓜香气,味感柔和、酸甜适口。产品中可溶性固形物4.8%,总糖12.8 g/100 ml,总酸3.2 mmol/100 ml。     

南瓜薄饼的配方研究

[目的]探讨制作南瓜薄饼的最佳配方.[方法]通过单因素试验研究了南瓜、白砂糖、人造奶油、小苏打和食盐的含量对南瓜薄饼饼干品质的影响并进行了感官品质鉴定;通过正交试验得出了制作南瓜薄饼的最佳配方并进行了质构分析.[结果]在南瓜75％,白砂糖10％,人造奶油20％,小苏打0.40％,食盐1.25％,其他成分适量的条件下,制作而成的南瓜薄饼风味显著且品质最优.[结论]研究制得的南瓜薄饼满足人们对于饼干品质的要求,并且营养丰富.     

2-甲基异茨醇降解菌阴沟肠杆菌Z5的分离鉴定及BAC文库的构建

从采集到的污水样品中分离得到1株高效降解2-甲基异茨醇(2-methylisoborneol,2-MIB)的菌株Z5,通过16S rDNA序列分析,鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)。该菌在以2-MIB为唯一碳源的培养基中能正常生长代谢。经气相色谱-质谱分析,发现该菌对2-MIB的降解率高达89.7%。同时,测定了Z5在不同质量浓度2-MIB中的生长情况,结果表明:当2-MIB质量浓度为16μg/L时,其生长状况与在LB中最为接近。为了克隆降解2-MIB关键酶的编码基因并进一步研究其降解途径,本研究构建了E.cloacaeZ5的全基因组BAC文库,该文库覆盖了大约8倍的基因组,共计810个转化子,外源片段平均大小为40 kb。