巴西橡胶树胶乳中黄色体破裂指数测定方法的优化

黄色体破裂指数是橡胶树胶乳生理诊断方法的一个核心指标,但目前使用的黄色体破裂指数测定方法存在重复性差、准确性不高的缺陷。以无性系热研7-33-97为材料,比较胶乳采集、样品保存、游离酸性磷酸酶活性的测定及总酸性磷酸酶活性的测定等几个环节对破裂指数测定的影响。结果表明：C-乳清是测定游离酸性磷酸酶活性的最佳样品,并于4 ℃放置24 h不会影响游离酸性磷酸酶活性的测定;全胶乳经冻融、震荡及去污剂处理后,可得到最高的总酸性磷酸酶活性;反应完毕后的离心速度对实验结果无明显影响。此方法具有重复性好、准确性高的特点,是一种适合黄色体破裂指数测定的方法。     

橡胶树黄色体B-乳清可溶性蛋白质电泳分离技术

黄色体B-乳清蛋白质与胶乳凝固密切相关,目前用来分离该组分蛋白质的电泳方法存在明显缺陷,影响到乳管堵塞机制的研究.采用Tris-甘氨酸和Tris-Tricine两种不同的缓冲系统,调整聚丙烯酰胺的浓度和交联度,比较不同SDS-PAGE法分离巴西橡胶树B-乳清中可溶性蛋白的效果.结果表明,通常使用的甘氨酸-SDS-PAGE法对B-乳清中低分子量蛋白分离效果差.Tricine-SDS-PAGE 三层胶系统分离低分子量蛋白有优势,但分离60 Ku附近的蛋白效果不好:16.5%T+3%C分离胶的Tricine-SDS-PAGE两层胶系统分离高分子量蛋白和低分子量蛋白的效果理想,是适合分离B-乳清中可溶性蛋白的方法,对于其他植物样品蛋白质的分离也有一定的指导意义.     

巴西橡胶树胶乳黄色体中多酚氧化酶的活性及其橡胶粒子凝集作用的研究

橡胶粒子凝集在乳管伤口堵塞中起重要作用,研究胶乳中橡胶粒子凝集相关蛋白对于阐明乳管伤口堵塞机制具有重要的意义。对巴西橡胶树初生乳管和次生乳管胶乳黄色体中的多酚氧化酶活性进行了检测,并分析了多酚氧化酶对橡胶粒子凝集的影响。结果表明,初生乳管和次生乳管胶乳的B-乳清蛋白种类有明显差异,但B-乳清都有较高的多酚氧化酶（PPO）活性和具有明显的凝集橡胶粒子的作用。标准PPO也具有凝集橡胶粒子的效应。DTT对标准PPO的活性具有明显的抑制效果,并抑制其对橡胶粒子的凝聚作用。本研究首次证明巴西橡胶树的初生乳管和次生乳管的胶乳黄色体中都含有PPO蛋白,PPO是有效凝聚橡胶粒子的蛋白质成分之一,为深入研究乳管伤口堵塞机制奠定了基础。     

乙烯刺激橡胶树胶乳黄色体蛋白差异初析

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳中的黄色体作为乳管细胞的一种细胞器,其稳定性受乙烯刺激影响。该试验从蛋白差异角度,选取未开割胶树,应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE),比较在乙烯刺激与未刺激条件下,黄色体蛋白的变化情况。结果表明,按蛋白表达量变化差异3倍及以上分析,胶树在乙烯刺激24h后,上调蛋白5个,下调蛋白2个;在乙烯刺激48h后,上调蛋白7个,下调蛋白1个;综合3个处理,先上调后下调的蛋白8个;先下调后上调的蛋白2个。应用质谱技术鉴定了其中部分差异表达蛋白,并进行初步功能分析,表明未开割橡胶树胶乳黄色体受乙烯刺激后,黄色体蛋白发生不同程度复杂变化,各组处理间变化明显。     

水稻CO39β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆

以CO39四叶期水稻苗的叶片为材料,提取水稻基因组DNA,通过PCR扩增获得水稻β-1,3-葡聚糖酶基因（CO39-β-1,3-Glu）,经序列测定得知该基因大小为489bp,通过Blastn搜索确定该片段位于水稻10号染色体。序列比对结果表明,CO39-β-1,3-Gill与己知的水稻Gns7和大豆Glycinesoja clone Gs522194a endo-β-1,3-glucanasegene,Glycine soja clone Gs464889-Bendo—β-1,3-glucanase gene三个基因的相似性分别为51．5％,47．2％和49．1％。CO39-β-1,3-Giu基因是β-1,3-葡聚糖酶基因家族的一个成员。     

糖化温度和内源β-葡聚糖酶对麦芽汁β-葡聚糖含量的影响

于 4 5℃制备麦芽汁时 ,从有酶活性和没有酶活性的粉碎麦芽中释放到麦芽汁里的 β -D -葡聚糖基准水平相近。当在 65℃糖化时 ,发现无论是用有酶活性的麦芽粉还是用没有酶活性的麦芽粉制备的麦芽汁里 ,β -D -葡聚糖含量水平都明显较高。总的说来 ,在糖化期间 ,在释放 β -D -葡聚糖方面 ,糖化温度可能比所谓 β-葡聚糖释放酶起着更为重要的作用。在这种情况下 ,应该把糖化期间β -D -葡聚糖的物理性释放与制麦过程中发生的 β-D -葡聚糖的酶释放和降解区别开来     

橡胶树胶乳中几丁质酶的研究进展

几丁质酶是一种分解N－乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶，在高等植物中，几丁质酶虽然普遍存在，但迄今未发现其底物的存在，据研究，几丁质酶在植物抗病机制中起重要作用，近年来，通过对橡胶胶乳中几丁质酶的研究，认识到它不仅是橡胶树防御病原微生物的抗病系统的重要组成部分，而且还参加了胶乳的凝固过程，与橡胶树的排胶及产量具有密切的关系，文章概述了几丁质酶研究的现状及最新进展，介绍了橡胶树胶乳中几丁质酶的理化性质，生理学功能，在细胞中的定位及其调控。     

大麦β-葡聚糖酶的研究和展望

主要存在于大麦糊粉层和盾片中的大麦 β -葡聚糖酶 (1,3- 1,4 - β -葡聚糖酶 )属于诱导酶 ,种子萌发期间受赤霉酸 (GA)诱导而激活。 1,3- 1,4 - β -葡聚糖酶和 1,3- β -葡聚糖酶基因是 β -葡聚糖酶基因家族中两类 ,这两类β -葡聚糖酶水解酶具有不同的特性和功能 ,它们与大麦的制啤和抗病密切相关 ,遗传工程将为大麦的品质改良和选育抗病品种提供新的机遇。     

燕麦β-葡聚糖的合成与积累

燕麦β-葡聚糖具有明显的保健功效,这方面的研究已引起国内外越来越多科学家的关注。燕麦β-葡聚糖具有β-（1,3）（1,4）两种糖苷键,而且排列有序,主要分布于籽粒糊粉层,通常与其它物质结合存在。燕麦β-葡聚糖是在高尔基体中合成的,但β-葡聚糖的合成过程目前还不清楚,β-葡聚糖合成酶（或复合体）可能是合成过程的关键酶。除遗传因素外,水分供应、总辐射、矿质营养、籽粒成熟期温度等环境因素均对β-葡聚糖含量有显著影响。     

乙烯利和乙烯刺激对橡胶树胶乳中几丁质酶活性和胶乳产量的影响

以巴西橡胶树无性系PR107,RRIM600,GT1为试验材料,研究乙烯利和乙烯刺激对胶乳黄色体中几丁质酶活性和胶乳产量的影响。结果表明:在乙烯利和乙烯的有效刺激浓度范围内,几丁质酶活性随乙烯利和乙烯浓度增加而增加;乙烯和乙烯利持续刺激一段时间后,几丁质酶活性达到最大值;3种不同排胶特性品系橡胶树在施用乙烯利刺激后胶乳中几丁质酶活性和胶乳产量较施用乙烯利刺激前均有所增加,其增加强度存在着品系差异,表现为:PR107>GT1>RRIM600。      

大豆疫霉菌诱导的β-1,3-葡聚糖酶与寄主抗病性的关系

为明确-1,3-葡聚糖酶与大豆抗大豆疫霉根腐病的关系,分别测定了具有不同抗性的3个大豆品种的真叶和第1片复叶被大豆疫霉菌侵染后β-1,3-匍聚精酶的活性,并分析其与抗病性的关系.侵染大豆真叶和第1片复叶后备品种的β-1,3-葡聚糖酶活性均明显升高.接种大豆真叶后抗病品种48 h出现酶活性高峰,酶活性增加105.9%;中感晶种和感病品种72 h出现酶活性高峰,酶活性增加量分别为66.3%和65.7%.接种大豆复叶后酶活性的变化与真叶反应一致.说明β-1,3-葡聚糖酶的活性与大豆品种的抗病性呈正相关,抗病品种较感病品种酶活性峰值出现早,酶活性增加量高.对酶的部分性质的研究结果表明:酶的最适反应温度为55℃,最适反应pH为5.0,在55℃以下,pH 4.5～7.5范匍内酶活性较稳定.Ca2+、Mn2+、K+、Al3+对酶均有激活作用,Mg2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+、Hg2+、Ba2+对酶有抑制作用.抑菌试验表明,β-1,3-葡聚糖酶粗酶液对大豆疫霉菌的菌丝生长和游动孢子萌发有明显的抑制作用.     

巴西橡胶树泛素结合酶基因HbUBC5的克隆和表达分析

根据先前获得的EST序列,从橡胶树中克隆了1个编码泛素结合酶的基因HbUBC5。HbUBC5 cDNA长度为567 bp,编码185个氨基酸;HbUBC5在基因组中序列长度为2 441 bp,包含6个外显子和5个内含子。HbUBC5编码蛋白具有典型的植物泛素结合酶E2的结构特征,包含1个保守的UBC结构域和1个高度保守的半胱氨酸活性位点,和其他植物中的E2蛋白具有很高的同源性。对HbUBC5启动子区域进行分析,发现含有众多应答激素和胁迫信号元件。实时荧光定量分析结果表明,HbUBC5在树皮的表达量最高,在花中的表达量次之,在胶乳和叶片中的表达量相对较低;乙烯诱导能显著上调基因的表达。研究结果表明,HbUBC5能对乙烯做出响应,推测其可能参与了乙烯利刺激橡胶树产生副作用的过程。     

糖化温度和内源β—葡聚糖酶对麦芽汁β—葡聚糖含量的影响

于４５℃制备麦芽汁时,从有再生产尖性和没有酶活性的粉碎麦芽中释放到麦芽汁里的β－Ｄ－葡聚糖基准水平相近。当在６５℃糖化时,发现无论是用有酶活性的麦芽粉还是用没有酶活性的麦芽粉制备的麦芽汁里,β－Ｄ－葡聚糖含量水平都明显较高。总的说来,在糖化期间,在释放β－Ｄ－葡聚糖方面,糖化温度可能比所谓β－葡聚糖释放酶起着更为重要的作用。在这种情况下,应该把糖化期间β－Ｄ－葡聚糖的物理性释放与制麦过程中发生的β－Ｄ－葡聚糖的酶释放和降解区别开来。     

应用粘度测定法测定麦芽中内源β-葡聚糖酶的活性

用于测定麦芽中内源β－葡聚糖酶活性的粘度测定法已由酿造学会分析委员会做合作试验。共有10个实验室参加试验，分析了5对麦芽样品，范围为176至1238IRV单位。重复性（r95）值为22至122IRV单位，重现性（R95）值为93至650IRV单位。结果表明，取决于内源β－箭聚精酶的活性水平的是R95而不是r95.总精确度值是：r95为76．8，R95为0．506X平均值十4．786。因此决定将这一方法编入IOB分析法里，但要注意这次试验和以往的合作试验中得到的精确度值都较差。     

温度对巴西橡胶树微体繁殖的影响

进行了温度对巴西橡胶树（Hevea brasiliensis)微体繁殖影响的研究。以巴西橡胶树的腋芽和顶芽为外植体，分别在26，28和30℃3种温度下进行组织培养，定期观测萌生枝的高度、直径、数量等多项指标。结果表明：在培养第50天时，腋芽繁殖系数26℃的2.6提高到28℃和30℃的4.6，提高了76.9%，在同样情况下，28-30℃的顶芽繁殖系数比26℃的提高50%左右；28℃的萌生枝直径略大于30℃和26℃的，30℃和28℃的萌生枝和萌动芽数量大于26℃的；30℃的枯顶数量略大于28℃和26℃的。综合指标说明：培养温度以28℃最佳，继代1次时间不宜超过50d。     

巴西橡胶树β-木糖苷酶基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树根为材料,利用RT-PCR技术从总RNA中捕获到一个β-木糖苷酶家族基因(β-xylosidase 或β-D-xyloside xylohydrolase,EC 3.2.1.37),cDNA长度2 880 bp,开放阅读框2 319 bp,编码773个氨基酸,命名为HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一个较强的跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbEC32在N端前8～20氨基酸区域内为较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个β-木糖苷酶蛋白进行系统进化分析发现,巴西橡胶树的HbEC32基因与蓖麻亲缘关系最近。     

低温促进巴西橡胶树排胶的生理基础

低温导致橡胶树的排胶时间过度延长(长流),影响到天然橡胶的高产稳产。目前对低温诱发长流的机制还不清楚。以排胶特性不同的橡胶树无性系RY8-79和PR107为实验材料,对冬季低温条件下胶乳的几个主要排胶生理参数进行了研究。结果表明:低温明显降低RY8-79和PR107胶乳黄色体的破裂指数和堵塞指数;明显升高硫醇以及过氧化氢的含量;胶乳排胶初速度和胶乳的p H值在2个品系中变化不明显。由此可见低温条件下胶乳中硫醇含量升高是促进橡胶树排胶时间延长的主要原因之一。该结果为深入阐明乳管堵塞机制和研发新型的排胶调节剂提供了参考依据。     

巴西橡胶树SUMO活化酶基因HbSAE1的克隆及表达

根据一个从巴西橡胶树胶乳cDNA文库中获得的EST片段的序列设计引物,通过RACE的方法获得了橡胶树编码SUMO活化酶(SUMO-activating enzyme,SAE)的cDNA,命名为HbSAE1。序列分析结果表明HbSAE1长为2 411 bp,含有1917 bp的阅读框,214 bp的5'-UTR和280 bp的3'-UTR,编码638个氨基酸,分子量为70.79 ku,等电点为5.41。半定量RT-PCR分析结果表明HbSAE1基因在花、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最高。     

利用瞬间表达技术分析小麦几丁质酶和β-1,3葡聚糖苷酶基因的抗病性功能

几丁质酶基因和β-1,3葡聚糖苷酶基因是植物抗病反应过程中的两类重要的病程相关蛋白（PR）基因。为了快速准确地评价此类基因组成性表达后的抗病效果及在分子育种上的应用价值。利用瞬间表达技术分别在感病小麦品种离体叶片表皮细胞中过量表达1个小麦几丁质酶基因Cht4和2个小麦β-1,3葡聚糖苷酶基因Glb3s2和Glb3s6,并以GUS基因的共表达标识阳性转化细胞。基因枪轰击后高密度接种白粉病菌孢子。40h后观察转化阳性表皮细胞度其表面抱子的发育,并以阳性转化细胞中白粉病菌成功侵入的细胞所占比例（侵入频率）为指标分析目标基因的表达对白粉病菌入侵及吸器形成产生的影响（对照为单独导入GUS基因的表皮细胞）。结果表明,小麦几丁质酶基因Cht4（侵入频率为18．3％,对照为25．04％）和小麦肛1,3葡聚糖苷酶基因Glb3s2（侵入频率为19．63％,对照为24.63％）在感病小麦品种叶片表皮细胞中的瞬间表达,对白粉病菌侵入和吸器形成均有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性。