甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性,本研究参照GenBank上公布的PMI基因序列,通过PCR从大肠杆菌克隆了6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因,并将以CaMV 35S和AmCBLIP两种启动子调摔的沙冬青AmCBL1基因成功地构建到重组载体pPMI上,并导入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥.将获得的阳性植株通过GUS组织化学法鉴定、氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,证明PMI基因已经转入拟南芥中.在不使用抗生素和除草剂的情况下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法,并且为以后AmCBL1基因的功能验证及植物抗逆性的改良奠定了基础.     

SNAC1基因作为筛选标记基因用于棉花的遗传转化

以SNAC1基因作为筛选标记基因,NaCl作为筛选剂,通过农杆菌介导法将SNAC1和GUS基因导入棉花细胞并得到胚性愈伤组织。经过PCR检测证实,外源基因已经整合到棉花基因组中,GUS染色证明GUS基因得到表达。研究了NaCl作为棉花转化细胞的筛选剂在农杆菌介导转化中的应用浓度及方法,即NaCl的筛选浓度在1.1%～1.5%(W/V)之间,在愈伤组织诱导初期适当低一点,随着愈伤组织的生长而加大筛选浓度。由于NaCl不利于胚的分化,经过2～3次继代筛选后要及时去除NaCl以促进胚的分化。     

以对潮霉素抗性为筛选标记的棉花遗传转化

以 HPT基因作为筛选标记基因 ,潮霉素作为筛选剂 ,通过农杆菌介导法将 GFP基因导入棉花细胞并得到再生植株。经过 Southern杂交证实外源基因已经整合到棉花基因中 ,荧光显微镜可以观察到绿色荧光 ,说明 GFP基因得到表达。研究确定了潮霉素作为棉花转化的筛选剂在农杆菌介导的转化中适用的浓度范围及筛选方法 ,即棉花转化中潮霉素的筛选浓度范围为 2 .5～ 1 0 mg· L- 1,在有 GFP等一些易于观察和检测的标记基因存在时 ,起始浓度可用较低 ( 2 .5 mg· L- 1)的筛选浓度 ;而在没有标记基因或检测方法较复杂时 ,起始浓度用较高 ( 1 0 mg· L- 1)的筛选浓度     

卡那霉素浸种筛选转基因棉花的初步研究

转基因技术已经被广泛应用于作物的抗虫、抗病及高品质等的改良育种 ,而且转基因植株的鉴定方法也有多种 ,其中带有NPTⅡ标记基因的转基因后代材料的大田筛选 ,主要是在苗期 ,利用卡那霉素溶液 (Kanamycin)点涂植株幼叶 ,以幼叶的变黄与否来确定。为防止漏点漏涂 ,出现假阳性植株 ,须在花铃期以前对材料点涂 2～ 3次 ,因此从大量的转基因材料中筛选转基因植株 ,工作量相当大。本研究的目的是试图筛选出适当的卡那霉素浓度 ,通过浸种以快速地鉴定出转基因植株。1　材料和方法1.1　供试材料转基因抗虫棉新棉 33B、非抗虫棉豫棉 11号和转基因…     

基因枪转化技术在棉花遗传转化上的应用

将外源基因导入棉花的方法很多,目前,最受瞩目的是农杆菌介导法和基因枪转化法。本文对基因枪转化法的基本原理、发展情况、技术的优缺点、影响转化率的主要因素以及此方法在棉花遗传转化中的研究动态进行了分析。     

转基因棉花后代早期快速筛选的应用研究

从转基因棉花后代分离群体中选择含有外源基因的目标植株是培育转基因棉花的重要环节。为了快速在早代对转基因棉花进行有效的筛选,本试验利用含有Kan的水溶液在培养皿上对转基因棉花YZ1进行筛选研究。结果表明,100mg/L的Kan能有效抑制非转基因棉花种子的萌发及下胚轴的伸长;经PCR检测,100mg/LKan筛选出的抗性苗阳性率达到95%以上。     

雄性不育基因对棉花的遗传转化

利用TA29、A6、A9三启动子功能区与barnase基因融合构建的不育基因以农杆菌介导法对棉花下胚轴进行了遗传转化,通过胚状体途径获得了转基因再生植株.利用150 mg·L-1高浓度卡那霉素(Km)对转化初期筛选出的再生苗进行再次筛选,提高了转化株的选出率.通过PCR检测和Southern dot blot分析从转基因胚状体再生植株中获得了带有barnase不育基因的120株转基因植株.进行转基因植株生物学性状检测和观察表明,所获得的转基因植株对溴苯腈表现出了明显的抗性,并从不育基因转化植株中筛选出了具有明显不育特征的雄性不育株.     

转基因棉花的田间筛选技术研究

利用不同浓度的卡那霉素对棉花叶片进行处理,较为系统地研究了棉花不同品种、不同叶位、不同生育时期内叶片对卡那霉素处理的反应。在此基础上建立了一种在田间对转基因棉花进行筛选的简便方法。研究表明,在棉花花铃期以前,利用5000～7500mg,L-1卡那霉素对转基因棉花新展开的倒1叶和倒2叶进行检测,能够有效筛选出带有卡那霉素标记基因的转基因后代,这对于转基因棉花材料的选育有较大的利用价值。     

棉花转基因技术及目标性状研究进展

棉花是一种重要的经济作物,在我国广泛种植。培育转基因棉花被看作是解决产量和生态环境问题最根本和最有效的方式。介绍了目前应用于棉花遗传转化的3种主要转基因技术,并综述了我国转基因棉花主要目标性状的研究进展。     

Main Achievements of Cotton Large-scale Transformation System

Cotton large-scale transformation methods system was established based on innovation of cotton transformation methods.It obtains 8000 transgenic cotton plants per year by combining Agrobacteriurn turnefaciens-mediated,pollen-tube pathway and biolistic methods together efficiently.More than 1000 transgenie lines are selected from the transgenic plants with molecular assistant breeding and conventional breeding methods.     

转兔角蛋白基因改良棉纤维品质研究

通过花粉管通道转基因技术,将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导入高产棉花品种苏棉16号。所用转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)及Gus报告基因。对转化体后代的检测结果表明,T1代有2.1%呈现Gus阳性,在Gus阳性株中84.6%具有卡那霉素抗性。用依据E6启动子序列和兔角蛋白基因序列设计的两对引物,对经过上述筛选的植株进行PCR检测,多次重复,最终确定3株结果稳定的转兔角蛋白基因棉株。从品质分析结果看,这3个株系成熟棉纤维的品质部分得到改良,尤其比强度有较大幅度提高,与转基因受体相比平均提高6.3cN·tex 1。     

甘露糖在棉花基因转化中对愈伤的诱导和分化的影响

在目前的植物转化系统中,要求在关注基因或目的基因转入细胞时,同时有标记基因存在。标记基因主要是抗生素或除草剂的抗性基因。借标记基因的表达可以将转化细胞从大量的未转化细胞中筛选出来。但抗生素或除草剂的抗性标记基因存在,对转基因作物的安全性有很大的影响。本文利用甘露糖异构酶基因对棉花进行转化,以甘露糖作为筛选剂分析对棉花愈伤诱导和分化的影响。1材料和方法1.1供试品种和菌种以晋棉7号、柯字312、泗棉3号作为供试品种。用于转化的农杆菌菌株为LB4404,内含甘露糖-6-P-异构酶基因。1.2实验方法1.2.1无菌苗制备。棉子经硫…     

风、蜜蜂因素对转Cry1Ac基因棉花花粉介导的基因漂移的影响

在温室内人工创造风力和释放传粉昆虫蜜蜂的条件下,应用PCR和蛋白试纸条结合的方法检测外源Cry1Ac基因通过花粉漂移至非转基因棉的频率和距离.结果表明:风力处理和蜜蜂处理的基因漂移频率均显著高于空白对照.漂移至非转基因亲本棉石远321的频率显著高于陆地棉中棉所35和海岛棉吉扎1号.漂移至石远321的频率随距离远近差异显著,而漂移至中棉所35和吉扎1号的频率在不同距离上差异不显著.风力处理共检测到阳性样本72个,在检测范围内,漂移至石远321的最远距离为25.6 m,漂移至中棉所35和吉扎1号的最远距离均为19.2 m.蜜蜂处理中共检测到阳性样本75个,在检测范围内,漂移到常规棉的最远漂移距离均达到设置最远处36 m,并在此处达到峰值.本研究可为转基因棉花基因漂移生态风险性评估提供参考.     

35S启动子甲基化引起棉花转基因沉默

 用带PBI121质粒的农杆菌LBA4404菌株转化泗棉3号胚性愈伤组织,获得的再生植株进一步对gus和nptⅡ基因进行PCR跟踪检测,共得到97株阳性转基因植株。GUS组织化学检测发现,97株转基因幼苗中有10株GUS检测阴性,嫁接后,只成活一株。利用来源于同一愈伤系的GUS检测阳性植株作为对照,对这一GUS检测阴性的植株进行gus基因沉默机理研究。Southern分析表明,该GUS检测阴性植株与GUS检测阳性植株有相同拷贝数。GUS组织化学检测和RT-PCR分析显示,gus基因在GUS检测阴性植株中没有表达,而nptⅡ基因在这两株转基因棉花中都表达。用限制性内切酶-PCR法分析35S启动子区甲基化发现：GUS检测阴性植株35S启动子区TATA box的HapII/MspI酶切位点发生甲基化,而GUS检测阳性植株该位点没有甲基化。以上研究表明,这株gus沉默的转基因棉花可能是由于其35S启动子区甲基化引起的。     

农杆菌介导海岛棉转化体系优化的研究

为建立高效规模化棉花转基因技术体系,解决棉花转化率受基因型限制、转化效率低以及转化苗畸形率高等问题。以棉花胚性愈伤组织作为受体,用农杆菌介导法将Bt基因导入海岛棉棉花品种‘新海16号’,在提高海岛棉遗传转化效率的同时,建立了相对高效地转基因再生植株成苗技术体系。结果表明：分3次依次继代于具头孢霉素浓度梯度的抗性愈伤增殖培养基,较3次均继代于含500 mg/L头孢霉素(Cef)的抗性愈伤增殖培养基MS₂,抗性愈伤增殖速度较快。且60天添加1次50 mg/L Kan时,转化苗成苗率达到最大值。降低NH₄⁺/NO₃^-水平对提高体胚发生率具有有效促进作用。选择继代90天后的愈伤组织,胚状体诱导率可达到最大值;继代180天以上的愈伤组织可以摒弃。经转化后所获的子叶畸形胚,具有较强再生能力,其产生的次生胚经再次培育出正常转基因植株这一途径可有效缩短转化周期。     

根癌农杆菌转化棉花花粉的研究

用根癌农杆菌感染棉花花粉获得的含有外源基因的花粉可与卵细胞自然结合,产生的转化细胞体不存在转化细胞与非转化细胞间的嵌合现象等问题,且转化方法简单,易操作。由于这种感染发生在花粉培养液中,为保证感染过程中花粉不破裂并具有生活力,以及使农杆菌有较高的感染力,必须有适宜的培养液,包括适宜的营养元素和渗透压。研究表明,在含有0.1%H3BO3、0.3?(NO3)2、0.2%MgSO4·7H2O、0.1%KNO3以及45%蔗糖的培养液中培养的花粉,能够保证有95%以上的花粉不破损且有生活力,且其萌发率平均可达58.5%。转化后的花粉经瞬时GUS检测和转化后花粉破损率表明,在附加有1‰体积比的Tween 20的含有农杆菌的花粉培养液中进行抽真空处理的方法是较有效的转化方法。所获得的种子萌发后经卡那霉素筛选、GUS稳定表达检测以及Northern杂交验证,获得4棵转基因植株。     

提高棉花花粉管通道技术转化率的研究

利用花粉管通道技术将含有IPT基因的双元表达载体质粒 pBG121 导入不同的陆地棉品种(中棉所10号、中棉所24和中棉所36)中,采取正交试验设计,探讨基因型、导入时间、导入DNA的浓度和化学诱变剂的浓度对棉花转化率的影响,筛选出了适宜提高棉花花粉管通道技术转化率的方法。应用结果表明,改进方法的转化率比传统的方法提高两倍。