羔羊体外胚胎高效生产技术研究（英文）

该研究旨在比较良种肉羊5周龄、13周龄羔羊激素处理后卵巢卵泡发育及体外胚胎发育的影响。通过FSH和孕马血清促性腺激素(PMSG)处理,比较卵巢上2~8 mm卵泡的数量及体外胚胎的发育情况。结果表明:5周龄羔羊卵巢发育的卵泡数和采集到的卵母细胞数(58.6±1.9、47.4±4.2)都高于13周龄羔羊卵泡数和卵母细胞数(14.4±4.1、11.6±1.7),且差异显著(P0.05)。5、13周龄羔羊卵母细胞受精后的卵裂率(60.0%±1.9%、61.6%±5.2%)及囊胚率(27.4%±2.1%、28.2%±3.7%),两者间差异不显著。     

萨福克羔羊卵泡诱导发育效果的研究

为稳定并提高萨福克羔羊卵泡发育效率,通过肌肉注射FSH和PMSG的方法,对可能影响萨福克羔羊激素诱导效果如羔羊日龄、体重、健康状况和季节等因素进行研究。结果显示:1)5~6周龄萨福克羔羊经激素处理后的平均卵泡数(114.18vs 22.17)、回收的卵母细胞数(82.54vs 12.83)以及可用卵母细胞数(72.79vs 10.83)极显著高于8~9周龄组(P0.01);2)体重在8~18kg之间的5~6周龄羔羊,不影响处理效果(P0.05);3)有疾病史的羔羊处理效果显著低于健康羔羊组(P0.01);4)春、秋季节对羔羊卵泡发育及回收的卵母细胞数没有影响(P0.05),但春季羔羊卵母细胞体外受精卵裂率(54.31%vs 73.93%)和囊胚率(21.34%vs 35.73%)显著低于秋季(P0.05);5)秋季羔羊胚胎移植受胎率(51.33%vs 26.07%)显著高于春季(P0.05);6)移植早期胚胎或囊胚期胚胎对受胎率没有影响(P0.05)。选择5~6周龄、体重在8~18kg之间、无疾病史的萨福克羔羊,能显著提高卵泡发育效率;秋季羔羊卵母细胞发育能力显著高于春季;相同季节内,移植早期胚胎或囊胚期胚胎受胎率间没有差异。     

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下,回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理,同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢,观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精,观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后,未处理组移植体回收率为85.4%,与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段,回收卵母细胞均处在GV期,平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚,2-细胞胚胎发育率为17.5%,未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成,有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体,平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚,其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚,GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%,囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05）,2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01）,处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,但不增加卵母细胞产量。     

羔羊体重与激素重复诱导对羔羊卵泡发育的影响

 为了研究体重和激素重复处理对羔羊卵泡及卵母细胞发育能力的影响,试验采用注射外源FSH+ PMSG的方法,对5~15周龄的羔羊进行激素处理,诱导其卵泡发育并活体采卵,卵母细胞体外培养。结果显示：(1) 体重居中（M组）的羔羊获得的卵泡数目多于体重较轻（L组）和较重（W组）的羔羊组,但各组之间差异不显著;M组卵母细胞数目多于其他两组,且差异显著（P<0.05）。(2）M组羔羊获得的卵母细胞体外发育卵裂率高于L组和W组,但各组间差异不显著;W组桑囊率高于其他两组,且与L组之间差异显著（P<0.05）。(3）重复处理组与初次处理组相比较,卵巢直径差异不显著,而重复处理组羔羊卵泡数目和获得的卵母细胞数目明显少于初次处理组,差异极显著（P<0.01）,同时,重复组获得的卵母细胞卵裂率和桑囊率均低于初次组。结论：羔羊体重居中,其卵母细胞数目和细胞的发育率均好于体重过轻过重的羔羊,重复处理后羔羊所获卵母细胞数目少于初次处理。      

猪囊胚的体外生产技术

利用屠宰场猪卵巢卵母细胞经体外成熟、体外受精后,体外培育至囊胚阶段,并以体外生产的猪囊胚细胞数来衡量囊胚质量.试验共对5 84 9枚猪卵母细胞进行体外成熟、体外受精,其中3974枚卵母细胞在体外受精后发生卵裂,卵裂率为6 6 4 %±1 6 % ,2 136枚发育形成囊胚,占卵裂胚数的5 6 2 %±2 4 % ,占卵母细胞数的36 7%±1 3% ;检查了98枚囊胚,其平均细胞数为4 1 6±1 8;另外又检查了4 7枚囊胚,其平均内细胞团细胞数为3 85±0 5 6、滋养层细胞数为4 4 70±2 87.     

细毛羊羔羊超数排卵及体外胚胎生产移植

[目的]研究羔羊日龄、羔羊体重、超排方法、精卵共孵育时间对细毛羔羊超排效果及卵母细胞体外受精效果的影响.[方法]用国产FS3H对4.～9周龄羔羊进行两种超排方法处理,回收可用卵母细胞1 032枚,体外受精后移植受体98只,产羔25只.[结果]不同周龄羔羊只均获卵数和可用卵数之间差异显著(P＜0.05);不同激素方案处理组的发育卵泡两种处理方案在发育卵泡数上无显著差异(P＞0.05),但在回收率和可用卵数上差异显著(P＜0.05);不同体重组只均发育卵泡数和可用卵数之间差异显著(P＜0.05).[结论]4～6周龄的细毛羊羔羊超排获得卵母细胞数目较多;重复超排的羔羊超排效果不理想;同时,将受精液pH值调为7.5 ～7.6,并将精卵共孵育时间控制在22 ～26 h,卵母细胞体外受精及发育效果较好.     

山羊不同来源卵母细胞体外受精的研究

从屠宰场搜集的小母羊(3-6月)卵巢卵母细胞(A组)、成年母羊卵巢卵母细胞(B组)及成年母羊超排后活体所取母细胞(C组)进行了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精后早期胚胎体外培养(IVC)的比较研究。研究发现: (1)A组平均每个卵巢获取的卵母细胞数极显著高于B组(10. 6±2. 6vs2. 5±1. 5,P< 0. 01),与C组相比差异不显著(10. 6±2. 6vs11. 0±2. 0, P> 0. 05),但获取的优良可用卵丘卵母细胞复合体(COCS)数A组极显著高于B组(4. 5±2. 5vs1. 6±1. 5,P< 0. 01),却显著低于C组(4. 5±2. 5vs8. 5±2. 5,P< 0. 05); (2)A,B,C组获取的可用卵母细胞在M199±10%EGS±20ng/mLEGF培养液中培养后的体外培养成熟率分别为63. 8%, 65%和68. 3%,差异均不显著(P> 0. 05); (3)3种来源途径的可用卵母细胞体外成熟后用mDM液获能受精处理并培养于TCM 199-卵丘颗粒细胞饲养层(cc)共培养体系中的卵裂率(37. 5%, 35. 0%和40% )无显著差异; 12枚活体来源卵母细胞生产的2-8细胞胚移植给4只同期化受体,其中1只母羊怀孕并产下2只“试管”羔羊(16. 7% )。研究表明:初情期前小母羊比成年母羊可提供更多可用于体外受精的卵母细胞,进而提高雌性动物的早期繁殖潜能;对遗传性能较好的品种或个体可通过超数排卵处理后利用合适     

金黄地鼠超排后未排卵泡卵母细胞的成熟度和受精能力的观察

为了证实金黄地鼠超排后卵巢中未排卵卵泡卵母细胞的成熟程度和受精能力,用促性腺激素PMSG和HCG进行4次超排处理,其中选择12只超排效率低下的金黄地鼠,回收输卵管和卵巢卵母细胞,观察卵母细胞的成熟程度、体外培养成熟能力及体外受精能力。结果显示,输卵管中回收超排卵数平均为22.6±7.8枚/只,从超排后卵巢中回收卵丘扩展卵数平均为23.2±3.9枚/只,卵丘未扩展卵数平均为13.4±3.7枚/只。卵丘扩展卵经0.1%透明质酸酶消化,裸卵占86.1%,带放射冠卵占11.5±2.4%。裸卵中排出极体的成熟卵占卵丘扩展卵的80.4±2.3%,无极体裸卵占5.7±0.8%。经体外培养2h,无极体裸卵的成熟率达100%,带放射冠卵的成熟率仅为6.3±9.4%,而卵丘未扩展卵未见有成熟卵。人精子穿透试验显示,卵巢回收成熟卵的受精率44.1±6.0%,同超排卵的受精率45.4±4.7%比较,无显著差异(P<0.05)。从低超排率的金黄地鼠卵巢中可获取与超排卵数相近的成熟卵母细胞,且具有可利用于去透明带金黄地鼠卵子穿透实验(HOP)及相关发育生物学研究的潜能。     

牛卵巢的保存与卵巢内卵母细胞采集的研究

利用屠宰牛的卵巢,研究了卵巢内(Interior Ovary,IO)卵母细胞的回收方法与影响IO卵母细胞回收数量的因素,以及卵巢保存方法对卵母细胞体外受精后卵裂率与体外发育能力的影响.结果表明抽吸采取表面卵泡卵母细胞以后,用间隔1.6 mm的4个刀片平行排列构成的切割刀,纵横切割秦川牛卵泡期卵巢,其卵母细胞回收数量最高.两次回收平均每个卵巢可获得26.45个A、B级可用卵,较单纯抽吸采卵(5.15个)提高了约4倍.刀距增宽或缩小都会降低卵母细胞的回收数量.牛品种不同对IO卵母细胞的回收数量有显著影响,以中国荷斯坦牛最多(34.25个/卵巢),秦川牛次之(21.75个/卵巢),山丹牛最少(8.25个/卵巢).牛繁殖状态不同对IO卵母细胞的回收数量有显著影响,以卵泡期最多(21.75个/卵巢),黄体期和妊娠期次之(分别为11.75、10.75个/卵巢),老龄退化期最少(4.25个/卵巢).回收的IO卵母细胞直径和透明带外径分别达(126.9±9.98) μm和(151.85±10.39) μm,均较表面卵母细胞(分别为136.05±6.09 μm和160.80 μm±4.23 μm)要小的多(P＜0.01).卵巢保存温度25～29℃与30～37℃对IO卵母细胞体外受精后卵裂率与6～8细胞胚发育率无显著影响(P＞0.05),但保存时间则有显著影响,超过6 h会显著降低卵裂率和6～8细胞胚发育率(P＜0.05).     

山羊卵泡数量对卵母细胞体外成熟的影响

分析山羊卵泡数量对卵母细胞体外成熟的影响,根据卵泡数量将卵巢分为3组,探讨卵泡多少对卵母细胞体外成熟的影响。卵泡数目大于14个的设为Ⅰ组,卵泡数目介于8~14个之间的设为Ⅱ组,卵泡数目在1~7个之间的设为Ⅲ组。3组卵巢来源的卵母细胞体外成熟率分别为61.68%、70.26%、63.09%;Ⅱ组的卵母细胞体外成熟率显著高于其他2组。3组之间孤雌激活胚、克隆胚的卵裂率和囊胚发育率无显著差异。来源于卵泡数介于8~14个卵巢的卵母细胞体外成熟率最高,卵巢卵泡数量仅影响卵母细胞的体外成熟率,对发育能力无影响。     

培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育的影响

[目的]提高卵母细胞体外成熟质量,优化猪早期胚胎体外培养体系。[方法]以改良TCM199,NCSU-23培养液为基础液,分别添加10%的猪卵泡液（PFF）和10%的优质胎牛血清（FBS）进行卵母细胞体外成熟培养,以成熟率、孤雌胚胎体外发育率等为指标,研究不同培养液对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的影响。[结果]猪卵母细胞在TCM199,TCM199＋FBS和TCM199＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（54.2±3.5）%、（68.5±3.2）%和（69.3±3.7）%,在NCSU-23,NCSU-23＋FBS和NCSU-23＋PFF组成熟42 h的成熟率分别为（51.6±3.3）%、（63.2±3.1）%和（65.5±3.5）%,添加10%的FBS和PFF在0.05水平上显著提高了卵母细胞成熟率;6组不同成熟培养液得到的成熟卵母细胞在孤雌激活后囊胚发育率差异不显著,但TCM199＋PFF组的囊胚细胞数（36.5±4.8）在0.05水平上显著高于TCM199和NCSU-23组的囊胚细胞数（18.7±3.2和15.5±2.4）。[结论]改良TCM199,NCSV-23培养液中添加10%PFF和10%FBS可显著促进猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎早期体外发育。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

有无透明带猪卵母细胞电激活参数的优化及体外培养方式的建立

[目的]摸索无透明带猪体外成熟卵母细胞(ZFOs)电激活的条件和无透明带孤雌激活胚胎(ZFEs)的体外培养方式,为手工克隆法生产广西巴马小型猪体细胞核移植奠定基础。[方法]用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活ZIOs、ZFOs,用不同培养方式(微滴法和微穴法)培养ZIEs和ZFEs,检查第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数。[结果]有带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为125 V/(mm.80μs),微滴法培养的囊胚发育率为(30.54±11.06)%;无带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为85V/(mm.80μs),微穴法培养,其囊胚发育率为(12.77±6.98)%;单次脉冲的激活效果好于多次脉冲。[结论]对有无透明带胚胎的培养方式,微穴法培养无透明带胚胎,微滴法培养有带胚胎较合适,一次脉冲可以有效激活卵母细胞。     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的采集、体外发育和体外成熟

采用机械法分离成年小鼠和１３日龄小鼠腔前卵泡，两组中每只小鼠平均回收率分别为４９２９±１０８１和７６８３±９１５个；腔前卵泡卵母细胞培养１０天后，两组恢复成熟分裂卵的比例分别为１９３％和２０９％。试验结果表明，小鼠腔前卵泡卵母细胞在培养后第５天开始发生ＧＶＢＤ，此后，ＧＶＢＤ和抛出ｐｂＩ的卵母细胞数量逐日增加。     

卵丘细胞对牛体外受精效果的影响

[目的]探索卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响.[方法]试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组.[结果]与卵丘细胞共培养时,部分脱除组的卵裂率及囊胚率(74.4％±4.1、53.7％±5.1)好于不脱除组(72.7％ ±5.1、52.4％±3.5),差异不显著(P＞0.05)、两者都好于全部脱除组(39.6％±4.5、l8.8％±4.6),差异显著(P＜0.05),且都显著优于对照组.卵丘细胞与褪黑素两者联合使用时,效果最佳.部分脱除组的卵裂率及囊胚率(79.8％±3.7、56.5％±5.1)好于不脱除组(78.2％±2.6、55.8％±4.6),差异不显著,两者都好于完全脱除组(48.3％±5.5、22.7％±4.3)及对照组,且差异显著(P＜0.05).[结论]该研究对奶牛和肉牛的生产提供了技术支持.     

颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响

试验系统研究了颗粒细胞对山羊卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。COCs、机械裸卵和自然裸卵的体外成熟率分别为68.3%、45.6%和6.1%,组间差异显著(P<0.05),卵裂率分别为41.5%、8.1%和0,差异显著(P<0.05)。对照组和15×104个/ml、150×104个/ml颗粒细胞组卵母细胞体外成熟率分别为65.9%、60.2%和64.6%,无显著差异(P>0.05),但均显著高于1 500×104个/ml(50.0%)和1.5×108个/ml(30.3%)颗粒细胞组(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系统卵母细胞成熟率为75.8%,显著高于150×104个/ml颗粒细胞条件培养液组(63.4%)和M199培养液组(66.7%)(P<0.05)。颗粒细胞单层共培养系卵裂率为50.0%,显著高于150×104个/ml条件培养液组(36.7%)和M199培养液组(38.2%)(P<0.05)。     

外源褪黑素对牛卵母细胞体外成熟的影响

 【目的】探索外源褪黑素（melatonin,MT）处理对牛卵母细胞体外成熟的影响从而优化牛体外胚胎生产体系。【方法】在牛卵母细胞成熟过程中添加不同浓度的MT,观察并统计其体外受精后胚胎的卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数。应用放射免疫分析法检测血清、卵泡液和成熟培养液内MT与孕酮（P）、雌激素（E2)、促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平的变化并检测卵母细胞的活力和活性氧（ROS）的浓度。【结果】存在于牛卵泡液中的MT浓度与血清中的相近,添加10-11 mol•L-1 MT组的P浓度（2.01±0.33）ng•mL-1显著高于对照组（（0.87±0.10）ng•mL-1,P＜0.05）。与对照组（（67.32±7.30）%）相比,10-9 mol•L-1 MT组卵裂率显著提高（（77.81±7.06）%,P＜0.05）,并能提高囊胚率且囊胚细胞数（（29.61±9.55）%,（90.30±28.74）个）,显著高于对照组（（19.64±9.22）%,（75.07±25.98）个,P＜0.05）;同时,10-9 mol•L-1 MT组卵母细胞的活力高于对照组,并能降低卵母细胞内的ROS含量但没有显著差异（P＞0.05）。【结论】牛卵泡液中存在MT,适当浓度的外源MT能促进牛卵母细胞体外成熟。     

特定电磁波照射对家兔体外受精的影响

家兔精液用特定电磁波（ＴＤＰ）照射３ｍｉｎ，精子体外获能采用ｍ—ＨＩＳ（１５ｍｉｎ）＋ｍ－ＤＭ（２－４ｈ）．家兔卵母细胞经ＴＤＰ照射５ｍｉｎ并体外培养１０－１２ｈ．家兔的卵泡卵母细胞经体外受精和体外培养的结果表明，经ＴＤＰ照射的精液与未经ＴＤＰ照射的卵母细胞的体外受精，原核形成率达６４．７％，对照织为４４．４％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５６．８％和５０％（Ｐ＞０．０５），经ＴＤＰ照射的卵母细胞与未经ＴＤＰ照射的精液的体外受精，原核形成率达６３．７％，对照组为４６．７％，两者差异显著（Ｐ＜０．０５），２－细胞以上的受精卵发育率分别为５８．９％和４７．２％（Ｐ＞０．０５）、用ＴＤＰ照射精液或卵母细胞能显著提高其体外受精率．