A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

分子伴侣对A型FMDV结构蛋白VP1在大肠杆菌中可溶性表达的促进作用

为获得具有活性的A型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)VP1蛋白,以重组质粒pUC57-MM-VP1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV VP1基因片段,并将该片段插入原核表达载体pET-28a构建重组质粒pET-28a-MM-VP1;之后将该质粒转入E.coli BL21(DE3)进行诱导,同时对诱导温度进行了优化。SDSPAGE显示,最佳诱导温度为18℃,VP1蛋白主要以包涵体形式高效表达;为了提高VP1蛋白可溶性表达,将重组质粒pET-28a-MM-VP1与pTF16共同转入E.coli BL21(DE3)进行诱导表达,并对表达条件进行优化。结果表明,分子伴侣有效提高了A-VP1重组蛋白的可溶性表达量,诱导最佳条件为18℃、0.1 mmol·L~(-1)IPTG、2 g·L~(-1)阿拉伯糖、诱导时间20 h。Western-Blot结果表明,得到的重组蛋白能够被抗FMDV的阳性血清识别,反应原性良好。     

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-PAGE电泳分析证明VP2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明,重组质粒E.coliBL21（DE3）在35℃,1.0 mmol/mL IPTG诱导6 h时条件下蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳检测的纯化目的蛋白约为90 kDa,与预计大小一致。VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。     

海洋双RNA病毒VP2e基因的克隆和表达

从海洋双RNA病毒(MABV)Y-6毒株基因组中克隆到VP2 e基因,将其连接到GST融合表达载体pGEX-6P-1,在大肠杆菌中表达,并对其表达条件进行了优化。通过温度和诱导物浓度优化试验,经SDS-PAGE和Western-Blot检测表明,在温度为37℃、IPTG浓度为0.1mmol/L时,表达的融合蛋白含量最高,占细菌总蛋白的28.6%。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白(N)重组表达条件的优化

为获得更高含量的可溶性N蛋白,对构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(pET-32a-N)的表达条件(如诱导温度、诱导时间、IPTG浓度)进行了优化.结果表明:N蛋白最佳诱导表达条件为18℃诱导17h、IPTG浓度0.2 mmol/L;优化后可溶性N蛋白的表达量为22.1 mg/L,比优化前37℃、IPTG浓度1.0 mmol/L条件下诱导4h提高了58.5％.     

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。     

O型口蹄疫病毒代表性抗原VP1基因的人工合成与表达及其免疫原性检测

通过对GenBank近10年内收录的O型口蹄疫(FMD)病毒 VP1基因序列的同源性比较分析,并根据中国、老挝、缅甸等国家FMDV流行毒株的基因序列,设计并合成了有群内抗原代表性的结构蛋白VP1全基因序列.将合成的序列克隆到原核表达载体pET-28a( )中,构建了VP1的表达质粒pETVP1.SDS-PAGE和Western-blot分析表明,该质粒的BL21(DE3)LysS转化菌在IPTG诱导下可特异性表达VP1蛋白,该重组蛋白以包涵体的形式存在,相对分子质量约30 000,能与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生特异性反应.动物接种试验表明,重组蛋白能诱导小白鼠产生特异性抗FMDV抗体.     

O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆与表达

以O型口蹄疫病毒(FMDV)流行毒株为研究对象,通过RT-PCR扩增出VP1基因,克隆至表达载体pET-32a中,分析比较不同地区O型口蹄疫病毒VP1基因序列,为构建VP1重组基因工程苗奠定基础．经测序表明,目的基因VP1已以正确的阅读框架整合至表达质粒中,应用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌,通过IPTG诱导方法,表达包含VP1基因产物的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western—blotting分析,表明表达蛋白表达量高,反应原性良好．     

绿色荧光蛋白（GFP）基因克隆及其表达培养基的筛选

为应用PET15b-GFP观察细胞内部结构等其他功能奠定基础，研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein,GFP）的基因克隆及其在不同种培养基条件下不同种感受态大肠杆菌细胞中的表达情况，通过克隆提纯PET15b-GFP质粒，将已插入单链抗体3E3和152的重组质粒pET15b-3E3-GFP和pET15b-152-GFP，运用转化的方法将重组质粒分别导入感受态的大肠杆菌细胞中（BL21，B cell，K12），在不同的培养基条件下使用异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导GFP基因进行表达，筛选出表达最好的并改良表达能力最弱表达条件。结果表明：重组质粒pET15b-152GFP-BL21在液态LB培养基中30℃、0.4mmol/L IPTG、180rpm诱导条件下培养显色最显著，在固态富集酵母培养基中30℃，1mmol/L诱导条件下培养显色最显著；表达能力最弱的重组质粒pET15b-152-GFP-B cell在富集酵母液体培养基中25℃、180r/min、0.4mmol/L IPTG的条件下诱导培养表达绿色荧光最显著；pET15b-152-GFP-B cell在0 mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L和1mmol/L IPTG的诱导条件下表达绿色荧光无显著差异。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测(英文)

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33Ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒结构蛋白基因VP1的克隆与原核表达(英文)

According to the complete genome of foot-and-mouth disease virus(FMDV)type O,a pair of special primers was designed to amplify VP1 gene.The VP1 gene was amplified by RT-PCR and subsequently inserted into the expression vector pGEX-6p-1 and induced by IPTG.Then SDS-PAGE showed the expressed protein was 51 kD in molecular weight.Then the product was purified by GSTrap FF columns.The product was detected through Western-blot that showed the protein has antigenicity.It provided fundamental data and materials for further investigation on diagnosis method of FMDV.     

口蹄疫病毒VP1基因在胡萝卜中的表达

为了生产一种可以直接口服的口蹄疫疫苗,以胡萝卜(Daucus carota L.var.sativa)无菌幼苗下胚轴诱导的愈伤组织为受体材料,通过农杆菌LBA4404介导的遗传转化,在CaMV双35S启动子的驱动下,将口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)结构蛋白VP1基因的活性肽片段(包括2个141~160位肽和1个200~213位肽的基因片段)导入胡萝卜愈伤组织细胞。经PCR和PCR-Southern杂交等方法鉴定转化苗,确认口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因已整合到胡萝卜染色体中,转化效率达到52%。SDS-PAGE试验结果初步证明,在转化苗总蛋白中有目的基因表达,胡萝卜种子中可溶性蛋白含量最高,达3.57 g/L,而根中可溶性蛋白含量最低,仅有0.17 g/L;靠近心叶的叶片可溶性蛋白含量可达到1.475 g/L,而最外部叶片可溶性蛋白含量仅有0.37 g/L,相差近5倍。Dot-ELISA和ELISA检测结果表明,转化苗中表达的口蹄疫病毒结构蛋白VP1可以与FMDV灭活疫苗免疫动物制备的抗体特异结合。以上试验结果证明,口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在转基因胡萝卜中表达成功。     

牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因表达条件的优化

将已构建并测序正确的含有牛瑟氏泰勒虫P23表面蛋白基因的pGEX-4T—P23转化菌用IPTG进行诱导表达,经SDS—PAGE电泳可检测到相对分子量为46．0ku的融合蛋白．根据SDS—PAGE确定融合蛋白的最佳表达条件,结果显示诱导时机和时间是影响表达的主要因素,诱导温度和IPTG浓度次之;确定最佳诱导时机为转接种后2．0h,最佳诱导温度34℃,最佳诱导时间6．0h,最适IPTG浓度0．08mmol／L．表达产物主要以包涵体存在,在优化条件下融合蛋白的表达量经Bandscan5．0软件分析约占菌体总蛋白的31．7％．     

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30的原核表达与抗体制备

苦瓜核糖体失活蛋白MAP30(Momordica charantia antiviral protein 30)是苦瓜中一种具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌等多种生物活性的蛋白质.将舍有重组表达质粒pET-28(a)-MAP30的大肠杆菌BL21进行诱导表达获得了重组蛋白MAP30,对IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导浓度、诱导时间表达条件的分析表明,工程菌经0.2mmol·L~(-1) IPTG诱导6 h实现高效可溶性表达.利用镍离子鏊合亲和层析对重组蛋白纯化,当洗脱液中咪唑的浓度为100 mmol·L~(-1)时,目的蛋白被洗脱的效果最好.将纯化后的重组蛋白免疫家兔,获得了特异性的多克隆抗血清.