玉米弯孢菌叶斑病重要流行环节的初步定量研究Ⅰ.孢子萌发及侵染

进行了玉米弯孢菌叶斑病孢子萌发及侵染环节的定性定量研究。结果表明：弯孢菌孢子在清水中或可直接萌发，或不能直接萌发。花粉粒及玉米叶面物质对弯孢菌的萌发有显著的促进作用。已萌发孢子干燥超过1min即丧失侵染能力。弯孢菌在15－35℃都可对玉米形成侵染，以25℃为最适侵染温度。孢子侵入适宜温度范围窄于附着胞形成温度，又窄于孢子萌发适宜温度，叶面结水时间需超过7h才能形成侵染。     

芸薹链格孢菌孢子萌发及附着胞形成的初步定量研究

采用常规流行学方法研究了芸薹链格孢菌的孢子萌发及附着胞形成.结果表明:一般浸入水中2h后就有少量孢子萌发,10 h孢子萌发率可达90％以上;孢子萌发时各个细胞均可萌发形成芽管,向不同方向伸长,形成附着胞,20 h附着胞形成率可达50％以上;花粉和叶面物质对孢子萌发有促进作用;孢子抗干燥能力较弱,萌发孢子只须经4h干燥即可完全丧失存活能力;芸薹链格孢菌孢子萌发及附着胞形成的温度范围均为10～25℃,15℃为孢子萌发及附着孢形成的最适温度,温度达40℃后孢子不再萌发.     

葱紫斑病发生及防治若干问题的初步研究Ⅰ.分生孢子萌发侵染、潜育显症及杀菌剂筛选

对葱紫斑病菌孢子萌发侵染、潜育显症、杀菌剂筛选等进行了研究。结果表明:葱紫斑病病原菌分生孢子在适温下的清水中3 h的萌发率可达到87%,附着胞开始形成,6 h后附着胞的形成达到高峰。分生孢子的侵入率和附着胞的形成率呈高度正相关;23~30℃适宜孢子萌发,25℃为孢子萌发的最适温度;萌发后干燥6 d后孢子死亡。氮、磷、钾肥均可显著降低葱紫斑病的侵染,且氮、钾肥对大葱抗侵染的效果好于磷肥。葱紫斑病的潜育期为3 d,其累积显症率与时间的关系曲线为“倒J”型;百菌清对葱紫斑病菌孢子萌发的抑制效果最好,新万生、大生和杀毒矾的效果次之,而多菌灵、甲基托布津、三唑酮效果较差。     

体外施用小分子RNA抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果

[目的]本文旨在分析体外施加靶向细胞色素b(Cytb)的小分子RNA对稻瘟病菌致病性的抑制作用。[方法]将稻瘟病菌与双链小分子RNA(ds-sRNA^MoCytb-21)共同孵育,通过测定孢子萌发效率和形态,确定小分子RNA对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成有抑制作用。在分别施加溶剂(对照组)或dsRNA^MoCytb-500(处理组)的情况下,使用稻瘟病菌菌株Guy11侵染水稻‘日本晴’,明确体外施加小分子RNA是否可以降低稻瘟病菌的致病能力。[结果]与对照相比,与小分子RNA共同孵育的稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。2′-O-甲基修饰(OMe)和硫代甲氧基修饰(SOMe)能够延长小分子RNA的抑制效果。用Guy11和dsCytb混合喷施的水稻病斑面积较对照组显著降低。[结论]体外施加特异性靶向稻瘟病菌Cytb的小分子RNA能够抑制稻瘟病菌的致病性,具有开发成为高效绿色环保RNAi药剂的潜力和价值。     

番茄叶霉病重要流行环节的初步研究Ⅰ.孢子萌发侵染、病斑潜育显症

通过室内和田间试验,对番茄叶霉病(Fulvia fulva)的重要流行环节——孢子萌发和侵染、病斑的潜育与显症进行了初步研究。结果表明:番茄叶霉病菌的分生孢子可以在清水中萌发,番茄叶面物质对孢子萌发有促进作用,侵染时未见附着胞形成。孢子萌发的最适温度为23℃;相对湿度高(98%~100%)、持续时间长(10~24 h)适于孢子萌发(萌发率为65.2%~98.2%)。萌发的孢子经3 d干燥后丧失存活能力。叶面结水时间长有利于孢子的萌发和侵染。建立了浸水时间与孢子萌发率、相对湿度与孢子萌发率和温度与相对孢子萌发率关系3个回归方程。番茄不同栽培品种叶霉病的潜育期不同,病害潜育期最短的为14 d。番茄不同生育阶段对病害潜育期和显症期的长短没有影响。接种后保湿时间愈长,病害潜育期愈短。建立了病斑持续显症时间与逐日显症率、逐日累积显症率关系的回归方程。     

萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响

橡胶树炭疽病是影响橡胶树割胶生产的重要病害之一,主要由胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌侵染引起的,在世界各大植胶地区引起了无数橡胶树叶片脱落,甚至整株死亡,给当地的橡胶产业发展造成了严重损失。本实验主要采用菌落生长速率法、孢子萌发测试法等常规植物病理学方法研究萘乙酸对橡胶树胶胞炭疽菌RC169生长速率、孢子萌发率和附着胞形成率的影响。结果表明,低浓度时萘乙酸对RC169菌丝生长、孢子的萌发和附着胞的形成具有促进作用,但随着用药浓度的升高,其促进作用变为抑制作用,且抑制作用随之规律性增强。     

葱紫斑病发生及防治若干问题的初步研究——I．分生孢子萌发侵染、潜育显症及杀菌剂筛选

对葱紫斑病菌孢子萌发侵染、潜育显症、杀菌剂筛选等进行了研究。结果表明：葱紫斑病病原菌分生孢子在适温下的清水中3h的萌发率可达到87％，附着胞开始形成，6h后附着胞的形成达到高峰。分生孢子的侵入率和附着胞的形成率呈高度正相关；23—30℃适宜孢子萌发，25℃为孢子萌发的最适温度；萌发后干燥6d后孢子死亡。氮、磷、钾肥均可显著降低葱紫斑病的侵染，且氮、钾肥对大葱抗侵染的效果好于磷肥。葱紫斑病的潜育期为3d，其累积显症率与时间的关系曲线为“倒J”型；百菌清对葱紫斑病菌孢子萌发的抑制效果最好，新万生、大生和杀毒矾的效果次之，而多菌灵、甲基托布津、三唑酮效果较差。     

草莓炭疽菌初期侵染过程显微观察

[目的]明确草莓炭疽菌(Colletotrichum fragariae)在侵染草莓叶片过程中病原菌的侵染致病过程,为防控草莓炭疽病提供理论依据.[方法]用草莓炭疽菌绿色荧光蛋白标记菌株LC0220-7GFP的分生孢子悬浮液接种离体健康草莓叶片,在荧光显微镜下观察病原菌的侵染过程及侵染结构.[结果]接种6~9 h为病原菌分生孢子萌发高峰期,接种9 h约90.00%的分生孢子已萌发;接种12~24 h为侵染结构形成高峰期,接种24 h约70.00%的芽管顶端产生附着胞并形成侵染钉开始侵染草莓叶片表皮细胞,有少量的菌丝开始直接侵染叶片表皮细胞,同时在寄主上表皮上有少量的附着枝形成;接种48 h为菌丝形成高峰期,菌丝大量形成并沿着表皮细胞延伸成网络状,叶片开始出现零星病斑;接种7296 h为分生孢子盘形成高峰期;接种96~120 h为产孢高峰期,接种96 h产生新的分生孢子,大部分病原菌完成一个侵染循环;接种144 h形成典型的炭疽病斑.[结论]草莓炭疽菌通过产生附着胞侵入或直接侵入草莓叶片表皮细胞,使草莓叶片发病,形成典型的炭疽病斑.     

玫烟色拟青霉孢子萌发和附着胞形成的影响因子研究

用不同种类、不同浓度的培养液离体培养玫烟色拟青霉孢子,观察其萌发过程,结果显示,玫烟色拟青霉孢子萌发可以产生单极芽管和双极芽管,而且芽管顶端膨大可形成附着胞,附着胞形态以球形和棍棒状为主;不同培养液中,孢子萌发和附着胞形成率不同,其中0.1%的菜青虫体壁浸出液(CL)培养液中孢子萌发率和附着胞形成率最高,分别达到79.01%和18.69%。不同基质对玫烟色拟青霉孢子萌发和附着胞形成的影响也不同,蝉翅较适合玫烟色拟青霉孢子萌发和附着胞形成。     

胶孢炭疽菌侵染杨树叶片的组织病理学研究

目的明确胶孢炭疽菌在杨树叶片上的侵染过程,为进一步从分子水平研究该菌的致病机制和杨树抗病分子育种奠定基础。方法用绿色荧光蛋白标记的胶孢炭疽菌菌株BH12-2的分生孢子悬浮液接种健康杨树叶片,采用光学显微镜和电子显微镜观察病原菌的侵染过程和杨树叶片的防卫反应。结果接种4h后,孢子开始萌发产生芽管;8h时芽管顶端形成附着胞;12h时成熟的附着胞中央形成侵染钉;24h时,孢子另一端萌发形成芽管和附着胞;48h后芽管不断分枝异化成菌丝并产生次级分生孢子;接种3d时,附着胞基部的侵染钉穿透寄主角质层和表皮细胞壁膨大形成侵染泡囊,侵染泡囊初始生长在寄主细胞壁和细胞膜之间,不穿透寄主的原生质体,随后产生初生菌丝和次生菌丝的分化;接种4~5d后,次生菌丝在寄主表皮和叶肉组织内大量扩展;第6d时,菌丝聚集在角质层下形成子座组织,并产生分生孢子梗和分生孢子。随着菌丝的扩展,叶片组织发生一系列的病理变化,在侵入点周围的叶肉细胞壁附近产生胼胝质,细胞壁向内凹陷并发生溶解,细胞质消解,叶绿体等细胞器解体以及寄主细胞坏死塌陷,最终在叶表面产生典型的褐色坏死病斑。结论胶孢炭疽菌在侵染过程中,一个分生孢子可萌发形成多个芽管和附着胞,提高其成功侵染的几率;胶孢炭疽菌对杨树叶片的侵染类型为细胞内半活体营养侵染型。      

Nutrient activation of Trichoderma fungal spores for improved biocontrol activity

The effect of preliminary nutrient activation on the ability of conidia of the antagonist Trichoderma harzianum P1 (ThP1) to suppress Botrytis cinerea was investigated in laboratory, greenhouse and field trials. Preliminary nutrient activation at 21 ℃ accelerated subsequent germination of the antagonist at temperatures from 9 ℃ to 21 ℃; at ≥ 18 ℃ the germination time of preactivated ThP1conidia did not differ significantly from that of B. cinerea. When coinoculated with B. cinerea,concentrated inocula of preactivated but ungerminated ThP1 conidia reduced in vitro germination of the pathogen by ≥ 87 % at 12 ℃ to 25 ℃; initially-quiescent conidia achieved this level of suppression only at 25 ℃. Application of quiescent ThP1 conidia to detached strawberry flowers in moist chambers reduced infection by B. cinerea by ≥85 % at 24 ℃ , but only by 35 % at 12 ℃. Preactivated conidia reduced infection by ≥60% at 12 ℃. Both quiescent and preactivated conidia significantly reduced latent infection in greenhouse-grown strawberries at a mean temperture of 19 ℃, while only preactivated conidia were effective in the field at a mean temperature of 14 ℃ on the day of treatment application.     

梨黑星菌接种体保存的研究

梨黑星菌接种体在低温干燥条件下保存10个月后仍有70％以上的分生孢子具有萌发力。在干燥条件下,低温有利于黑星菌接种体的保存。-18——20℃和3—5℃保存的分生孢子萌发率分别为72.43％和71.02％,而室温保存的分生孢子萌发率为0。离体接种和田间接种表明,在接种点上,低温干燥保存的梨黑星菌接种体分生孢子与新鲜孢子一样具有侵染力。而且在田间接种下,接种16天后均引起接种部位的发病。     

莱氏野村菌云南菌株的宿存时间特征研究*

 室内测定了莱氏野村菌云南菌株NE050913和NE050909在土壤中及在不同温度下的宿存时间特征。结果表明，莱氏野村菌接种于土壤后随时间的延续，活孢率逐渐降低，在土壤中宿存3个月以上活孢率迅速降低，接种119d时孢子全部失活。每g土壤中两菌株CFU的对数与处理后的天数x成线性相关关系，其中菌株NE050913 的时间-CFU对数的关系式为lg y=7.7029-0.1932x,（R=0.89），半衰期为41.4d；菌株NE050909的时间-CFU对数的关系式为lg y=6.8531-0.1475x（R=0.854），半衰期为49.5d，即菌株NE050909分生孢子失活快于菌株NE050913。在4℃和22℃条件下存贮菌株NE050913的分生孢子，随着存贮时间的延续，孢子活性渐降低，22℃条件下孢子活性的下降明显快于在4℃条件下存贮的孢子，22℃存贮的孢子的萌发率在86d时已经失去萌发能力，而4℃存贮的孢子仍有16.3%的萌发率。由此表明，在22℃条件下不利于莱氏野村菌分生孢子的存贮，4℃条件下可作为临时存贮。     

不同油茶物种抗炭疽病的组织病理学初步研究

用扫描电镜和光学显微镜观测油茶炭疽病菌(Colletotrichum came-lliae Massee)分生孢子在三种不同抗性的油茶物种叶表面的萌发习性及侵入途径。结果表明,抗病和感病物种间分生孢子的萌发率无显著差异,但芽管萌发的长度与油茶物种的抗病性呈正相关,附着胞数与油茶物种的抗病性呈负相关。组织病理学研究结果表明,抗性不同的油茶物种对于病程中各阶段出现的时间及反应的程度各不相同。在感病物种上病菌发育顺利,潜育期短;在抗病物种上病菌发育与菌丝扩展缓慢,病变组织的范围小。病变过程中,受浸染部位及附近的叶肉细胞普遍产生一种被番红染成红色的小颗粒状物质,该颗粒物质的产生可能与油茶物种的抗病性有关。     

温度·湿度对贮藏片烟霉菌影响的研究

研究了储藏片烟霉菌的营养生长、分生孢子萌发和芽管伸长的温湿度范围,并在液体培养基中测定了温度对菌丝生长的影响。结果表明:菌丝体营养生长的温度范围为10～35℃;20～30℃范围有利于分生孢子萌发和芽管伸长,芽管伸长以30℃最佳,而葡枝根霉为25～40℃,且分生孢子萌发以35℃最佳。液体培养中,曲霉菌和青霉菌温度为25℃时菌丝生长量最大,毛霉菌和根霉菌分别为10℃和35℃。曲霉菌在相对湿度为70%～75%时菌丝生长速率最大,而青霉菌和毛霉菌在相对湿度为90%,葡枝根霉菌为85%。分生孢子的萌发对湿度要求严格,在相对湿度>60%时霉菌孢子才能萌发,且在自由水和有水膜的情况下,萌发的更好。     

重寄生放线菌F46和PR对灰葡萄孢的抑制作用

测定了2株重寄生放线菌对灰葡萄孢的作用效果。结果表明,重寄生放线菌F46(Streptomycessp.)和PR(Streptomycessp.)对灰葡萄孢分生孢子萌发和芽管伸长都有一定的抑制作用,镜检可以观察到F46和PR在灰葡萄孢菌丝上产生附着胞、缠绕靶标菌丝,使靶标菌丝畸形等现象;诱发接种后2株重寄生放线菌对苹果、草莓、番茄采后灰霉病均有不同程度的控制作用,在低温下的防效优于高温,提前诱发接种的防效优于同时接种。     

大蒜提取物防治黄瓜黑星病的初步研究

测定了大蒜提取物对黄瓜黑星病菌(C lad osp orium cucum erinum)的抑制作用和对苗期黄瓜黑星病的防治效果,并对黑星病菌在经大蒜提取物处理后的黄瓜叶片上的侵染过程进行了组织病理学观察。结果表明,0.3 g/mL的大蒜提取物可以完全抑制病菌菌丝生长和分生孢子萌发,该浓度大蒜提取物能有效预防病菌的侵染,作用效果优于多菌灵,但其治疗作用较差。组织病理学研究表明,大蒜提取物可以有效阻止病菌在叶片上的萌发和附着孢的形成,从而阻断病菌的侵入过程。     

RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株（HeBHH1/95）为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株（SM）接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5-6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示：8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10-24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。