福建黄兔促卵泡素β亚基(FSHβ) cDNA序列的克隆与序列分析

从性成熟的福建黄兔母兔脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段,获得长为390bp的黄兔促卵泡素β亚基cDNA片段。将扩增的片段与pMD18-T载体连接,转化至DH5α感受态细胞中。随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与包括人、奶牛、绵羊、水牛、小鼠在内的多种哺乳动物基因序列进行同源性分析,同源性相似度72.2%~96.5%,同时遗传进化分析结果表明,兔形目的FSHβ基因与灵长目动物的亲缘性更高。对福建黄兔与日本白兔已提交的FSHβ亚基的cDNA序列进行比较,发现在81bp及219bp处存在C→T和G→A两处突变,但未引起氨基酸变化。     

促卵泡素(FSH)对山羊卵巢卵泡群生长发育的影响

试验研究了促卵泡素对山羊卵巢卵泡群生长发育的影响。６只母羊在发情周期的１３～１６ｄ用激素处理,处理前摘取左卵巢,处理后３ｄ摘取右卵巢,组织切片,检测卵泡数。结果显示：当卵母细胞由２层卵泡细胞包围时,开始形成透明带;当达５层以上时,开始形成腔隙。超排和未超排（对照）卵巢上小卵泡数差异不显著（Ｐ＞０．０５）,分别为３７２１±１１２个和３６８５±１５６个;而带有５层以上卵泡细胞的卵泡数差异显著（Ｐ＜０．０５）,分别为１４０±２０．３个和１１０．０±９．１个;卵泡腔形成后的卵泡数差异非常显著（Ｐ＜０．０１）,分别为７５．０±２０．２个和３２．０±１０．１个。带有１～２层卵泡细胞时期的卵泡直径大约３１．６±１．７μｍ,带有３～４层卵泡细胞的卵泡直径大约为５２．３±５．０μｍ,带有５层以上卵泡细胞的卵泡直径为１５１．２±７２．１μｍ,卵泡腔形成后的卵泡直径为０．４～３ｍｍ。     

沼泽型水牛促卵泡素基因β亚基的克隆与序列分析

根据GenBank公布的奶牛FSHβ亚基的编码序列设计1对特异性引物,成功克隆出广西沼泽型水牛FSHβ亚基cDNA,并将其序列提交到GenBank,获得接受号为EF710660。以DNA Star生物分析软件对其同源性进行分析,结果表明,广西沼泽型水牛与已公布的印度水牛（Bubalus bubalis）的FSHβ亚基cDNA序列的同源性最高,达99%,与绵羊（Ovis aries）为96%、牛（Bovine）为95%、山羊（Capra hircus）为95%、梅花鹿（Cervus nippon）为95%。     

牛促卵泡激素基因克隆筛选和序列分析

从牛垂体中分离出总mRNA,经逆转录酶及大肠杆菌DNA聚合酶合成双链cDNA,经T4DNA聚合酶切成平末端后与Sma I酶切的pUC19连接,转化JM83,构建了脑垂体mRNA的cDNA文库.用标记的牛促卵泡激素基因的寡核苷酸片段进行杂交,从文库中筛选到几个阳性克隆,其中一个含有全长的牛促卵泡激素基因编码序列.利用PCR扩增技术从cDNA中扩增出了387bp的牛促卵泡激素基因,序列分析表明,10号克隆中的牛促卵泡激素基因含有起始密码ATG及终止密码TAA,所编码的氨基酸序列与天然牛促卵泡激寡素的氨基酸序列相同.     

哺乳动物卵泡闭锁的研究

哺乳动物的卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程，也是一种选择性的生理性细胞死亡过程。研究卵泡发育和闭锁对于提高动物繁殖力和胚胎工程发展有着相当重要的意义。本文主要在哺乳动物的卵泡闭锁与细胞凋亡、卵泡闭锁的调控因子、卵泡闭锁的相关基因以及卵泡闭锁的相关生殖激素等方面进行了综述。     

文昌鸡促卵泡素受体基因多态性分析

以促卵泡素受体(FSHR)基因作为影响鸡繁殖性状的候选基因,采用PCR-SSCP技术结合测序对编码FSHR胞外区部分的第1外显子(exon1)至第9外显子(exon9)共9个外显子区域进行单核苷酸多态性(SNPs)分析,寻找与鸡繁殖性能相关的遗传标记,为高繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。结果表明:在exon2、exon4、exon6、exon8区域存在SNPs位点,分别在exon2片段中编码区5′端-49 bp处的C→T突变;exon4片段中编码区43 bp处的T→C突变,但未引起氨基酸的改变;exon6片段中编码区3′端+12 bp处的A→G突变;距exon8编码区3′端+38 bp处的G→T突变。经适合性检验,各基因的基因频率在群体内的分布均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。FSHR是促卵泡素的特异性受体,这些位点的多态为进一步研究FSHR基因多态性对文昌鸡繁殖性能的遗传效应奠定了基础。     

超数排卵效果不同绵羊卵巢卵泡促卵泡素受体的分布

 【目的】探讨在具有不同超数排卵效果的绵羊品种中,进行超排处理后其卵巢上促卵泡素受体(FSH receptor,FSHR)的分布情况,为进一步研究二者的相关性及据此改进超排效果奠定基础。【方法】根据超数排卵效果优劣依次选择3个中国地方品种的绵羊：小尾寒羊、白滩羊和乌珠穆沁羊。在常规超排最后一次注射FSH后的8、16和24 h分别各取3只绵羊的卵巢,并采用免疫组织化学法观察3种绵羊卵巢上FSHR的分布情况。【结果】FSHR主要分布于3个品种绵羊卵巢的颗粒细胞上;小尾寒羊最后一次注射FSH后8、16和24 h的各时期卵泡中FSHR的表达都显著高于另外两个品种绵羊(P＜0.05),在早期卵泡和中期卵泡中,白滩羊的FSHR表达量也高于乌珠穆沁羊;3个品种绵羊在最后一次注射FSH后第8、16、24小时,其晚期卵泡FSHR表达阳性率都显著高于各自相应的早期和中期卵泡(P＜0.05)。【结论】推测出3个不同地方品种绵羊的卵巢对FSH处理的敏感性应该依次为：小尾寒羊＞白滩羊＞乌珠穆沁羊,表明绵羊超数排卵效果与其卵巢上FSH受体分布存在一定联系。     

促卵泡素对犬卵母细胞体外成熟的影响

为探究基础培养基中添加促卵泡素(FSH)对犬卵母细胞体外成熟的影响,采用切割法收集卵巢表面的卵丘卵母细胞复合体(COCs),培养在添加不同浓度FSH(0,0.1,1,10 IU/mL)的TCM-199基础培养液中.体外培养72 h后,对卵母细胞进行染色观察其细胞核成熟情况.结果表明,FSH的添加没有增加犬卵母细胞恢复减数分裂的细胞数量.此外,不同处理对卵母细胞卵丘扩散无差异.     

Preparation and Characteristic Identification of Monoclonal Antibody Against Sulfamethazine

Sulfamethazine is commonly incorporated into livestock feed as promotants of growth and for control of certain diseases in animals. It is retained in tissues of animals eating medicated diet. Consumption of meat from animals containing sulfamethazine may …     

氟虫腈单克隆抗体制备及其性能分析

利用氟虫腈类似物FH作为半抗原,与蛋白偶联后免疫Balb/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,得到产生阳性抗体的杂交瘤细胞株3C3。经过各项条件优化建立的间接竞争ELISA方法对氟虫腈最低检测浓度为0.074ng·ml-1,抑制中浓度为5.99ng·ml-1。抗体与定虫隆、三氟氯氰菊酯、氟乐灵、氟虫脲的交叉反应率小于0.67%。对添加到两种不同基质中的氟虫腈进行检测,结果变异度为1.8%～9.8%,回收率为94.7%～108.0%。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

多环芳烃-菲单克隆抗体制备及鉴定

为快速、准确检测环境中的菲(Phe),研究制备了抗菲单克隆抗体,并分析了抗菲单克隆抗体的免疫学特性。采用活泼酯法将2-菲丁酸与载体蛋白(BSA、OVA)共价连接制备免疫抗原(Phe-BSA)和检测抗原(Phe-OVA)。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描图谱分析及计算偶联比验证偶联结果。采用足垫法免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术、阳性杂交瘤筛选及克隆制备出抗菲单克隆抗体。结果表明:完全抗原制备成功,获得1株能稳定分泌抗Phe抗体的杂交瘤细胞株1G7,纯化后抗体效价为1∶6.4×105,亲和力常数为3.29×108L/mol。该单克隆抗体亚型为Ig G1,对Phe的IC50值为17.82 ng/m L,与5种多环芳烃具有交叉反应,可用于对环境中多种PAHs的广谱检测。     

三聚氰胺单克隆抗体制备与鉴定

[目的]制备抗三聚氰胺单克隆抗体,并对其效价、敏感性与特异性进行测定。[方法]通过三聚氰胺人工抗原MEL-BSA免疫BALB/c小鼠以及细胞融合等方法,获得分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并利用小鼠体内腹水诱生法制备抗三聚氰胺单克隆抗体;采用间接竞争ELISA法鉴定单克隆抗体的效价、敏感性与特异性。[结果]经小鼠免疫、细胞融合与亚克隆后获得了2株分泌抗三聚氰胺单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B12和2H9;间接ELISA检测结果显示,杂交瘤细胞1B12和2H9腹水型单抗的效价分别为1∶25 600与1∶12 800,IC50分别为8.0 ng/ml与8.3 ng/ml,且该2种单抗只与三聚氰胺有反应,与三聚氰胺类似物无交叉反应。[结论]该研究获得了高效价、高灵敏度的三聚氰胺特异性单克隆抗体,为后续研究提供了良好基础。     

抗庆大霉素单克隆抗体的制备及其初步应用#br#

 【目的】制备抗庆大霉素(gentamicin,GM)的高亲和力特异性单克隆抗体,并鉴定其免疫学特性,为进一步研究GM快速检测试剂盒和试纸条打下基础。【方法】用EDC法将BSA和OVA分别和GM偶联作为免疫原或包被原,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。用合成的BSA-GM免疫Balb/c小鼠,经过4次免疫后,用间接ELISA和阻断ELISA选择细胞融合备用鼠,选择高效价、敏感的小鼠进行抗原超强免疫;取其脾细胞应用杂交瘤技术与骨髓瘤细胞建立分泌GM 单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)的杂交瘤细胞株;用体内诱生腹水法制备GM mAb,对GM mAb的效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定,;应用阻断ELISA试验原理组装GM-Kit,并对鲜奶中添加的GM标准样品进行测定。【结果】SDS-PAGE电泳鉴定表明BSA-GM人工抗原偶联成功;免疫的3只小鼠血清抗体效价均达到10-3;其中2号小鼠血清GM抑制效价较高且IC50最低,达17.28 ng•mL-1,融合后筛选出5E2-D7、1A3-A9、5E2-A12和2A6-B5共6株敏感特异的杂交瘤细胞,其细胞培养上清液效价分别为1﹕1600、1﹕800、1﹕800和1﹕800,腹水效价分别为1﹕2.05×107、1﹕5.12×106、1﹕2.56×106和1﹕2.56×106,5E2-D7株对GM的IC50为0.30 ng•mL-1,与链霉素、卡那霉素等其他氨基糖苷类抗生素无交叉反应性;检测鲜牛奶样的平均添加回收率分别为96.0%,平均变异系数均低于15%。【结论】本试验获得了高效价、敏感、特异的抗GM mAb,为GM残留检测奠定了坚实的基础。     

抗链霉素单克隆抗体的制备及其初步应用

【目的】筛选抗链霉素特异性单克隆抗体,并初步建立其竞争ELISA快速检测方法。【方法】用EDC方法将链霉素(SM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原SM-BSA及SM-OVA,SM-OVA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后,SM-BSA包被酶标板,ELISA筛选阳性克隆,并经有限稀释单克隆化及亚型鉴定,所获阳性克隆注射BALB/c小鼠,制备单抗腹水,并进一步western-blot鉴定其特异性,并对其竞争ELISA检测方法进行优化。【结果】经有限稀释,获单克隆抗体7株,其中链霉素特异性单克隆抗体1株,对其竞争ELISA反应条件进行了优化。【结论】获抗链霉素单克隆抗体1株,并初步建立了其竞争ELLISA方法。     

新城疫病毒单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化的新城疫病毒ND35免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合.经筛选,获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株.特异性试验表明,7G5单克隆抗体仅与ND35病毒株反应,而不与禽流感病毒AIV(H5亚型)、产蛋下降综合症病毒(EDS-76V)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、马立克氏病毒(MDV)、禽肺病毒(APV)反应.通过Western-blot对7G5单克隆抗体进行鉴定,发现其在相对分子质量47 500～62 0130之间出现条带,表明其与NDV抗原有特异性结合.这5株单克隆抗体属于IgGl、IgG2b亚类,κ轻链.     

抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

 【目的】制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体（single chain variable fragment,ScFv）基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础。【方法】利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达。【结果】获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1、2D12B6、3D8A10。成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区（VH）基因有360 bp,轻链可变区（VL）基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白。【结论】试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础。     

磺胺间二甲氧嘧啶(SDM)单克隆抗体的制备及初步鉴定

用磺胺间二甲氧嘧啶人工免疫原(BSA-SDM)免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术筛选抗磺胺间二甲氧嘧啶单克隆抗体(SDMmAb)杂交瘤细胞,体内诱生腹水法制备SDMmAb,并鉴定其免疫学特性;鉴定结果表明,筛选出3株杂交瘤细胞,单克隆抗体的蛋白亚型为IgG1;分子量为178.1KDa,染色体数目为76～87条。与其他7种磺胺药(SD、SMM、SMZ、SQ、ST、PST、SMT、SPD)有很高的交叉反应性,可用于推广磺胺类药物多残留快速检测试剂盒的研制应用。