鸡防御素基因GAL-2的克隆及其真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。     

从江香猪源干扰素γ植物表达载体构建及在生菜中瞬时表达

为构建从江香猪源干扰素γ(IFNγ)植物表达载体,通过农杆菌真空渗透法在新鲜生菜中实现瞬时表达。参考GenBank登录的猪IFNγ基因序列设计1对特异性IFNγ引物,采用RT-PCR方法从贵州从江香猪源肝脏组织扩增IFNγ基因序列,将其克隆至植物表达载体PBI121,转化根癌农杆菌LBA4404,筛选阳性菌株提取质粒,对重组质粒进行PCR扩增、双酶切及测序鉴定;携带重组质粒根癌农杆菌真空渗透法感染生菜,GUS染色检测感染的生菜叶片,ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白,分析重组质粒在生菜中表达效果;采用细胞病变抑制实验检测生菜中从江香猪源IFNγ蛋白抗病毒活性。结果表明:本研究成功地从贵州从江香猪源肝脏组织扩增获得IFNγ基因序列并构建了从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ;GUS染色感染的生菜叶片可见蓝色物质;ELISA检测感染生菜叶片中从江香猪源IFNγ蛋白含量为169.397、170.657、170.37 pg/mL;生菜中表达从江香猪源IFNγ经4^-6稀释在Marc145细胞上仍能够抑制100 TCID50的PRRSV的致细胞病变作用。本实验成功构建从江香猪源IFNγ植物表达载体PBI121-IFNγ,生菜中瞬时表达蛋白具有免疫反应性和抗病毒活性,为从江香猪源IFNγ药用植物蛋白的研究开发提供参考依据。     

稳定高效表达猪CD163的Marc-145细胞系的构建与鉴定

试验旨在构建一株高效表达猪CD163(pCD163)的Marc-145细胞系,为猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的临床分离和疫苗生产奠定基础。根据GenBank中序列设计引物从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中扩增pCD163基因,将其插入真核表达载体pCI-neo构建真核表达质粒pCI-pCD163,将该重组质粒转染Marc-145细胞,通过G418筛选、单克隆化并扩大培养筛选获得表达pCD163的Marc-145细胞系,IFA、Western blotting鉴定其表达情况。IFA结果显示,构建的pCD163-Marc细胞系中荧光明显亮于普通Marc-145细胞;Western blotting结果显示,pCD163-Marc细胞系中CD163蛋白表达量约为对照Marc-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。且该细胞系可稳定传至20代,各代次之间表达量无差异。证明高效表达猪CD163的Marc-145细胞系构建成功。     

稳定转染CD151或CD163的Marc145细胞系的建立及其在PRRS疫苗生产中的应用

为了进一步探讨提高PRRSV感染靶细胞滴度的有效方法,本研究采用脂质体介导方法,通过G418筛选稳定转染Marc145细胞,并利用单个细胞克隆技术,获得了稳定超表达CD151蛋白和(或)CD163蛋白的Marc145细胞株,经免疫荧光化学和Western Blot鉴定证实,成功表达出基因重组猪CD151蛋白和CD163蛋白。在GMP生产车间将超表达CD151、CD163蛋白或CD151/CD163蛋白共表达的Marc145细胞感染PRRSV,使病毒感染滴度提高了10倍以上。将上述收获的病毒液制备了灭活苗,疫苗效力超过部颁标准。     

靶向PRRSV的FnCas9-rgRNA敲除载体构建研究

为了检测靶向猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的FnCas9-rgRNA敲除载体是否构建成功,试验先构建FnCas9-rgRNA敲除载体骨架并对其进行测序,然后将黄色荧光蛋白(EYFP)、PRRSV分别与各自的FnCas9-rgRNA敲除载体转染至HEK293、Marc145细胞内,通过流式细胞仪分析HEK293细胞内的荧光强弱及Marc145细胞的病变程度,并对FnCas9-rgRNA敲除载体的初步构建、载体活性进行研究。结果表明:FnCas9-rgRNA敲除载体骨架测序正确,流式细胞仪分析显示FnCas9-rgRNA敲除载体对HEK293细胞内EYFP基因的表达产生明显抑制作用,表达荧光的细胞数量明显下降,3种针对PRRSV设计的rgRNA分别与FnCas9表达载体共转染细胞,接种病毒后Marc145细胞病变程度明显降低。说明靶向PRRSV的FnCas9-rgRNA敲除载体构建方式正确且FnCas9-rgRNA敲除载体具有活性。     

Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域的克隆表达及抗体的制备与纯化

应用RT-PCR技术从Marc145细胞中克隆出SHP-1、SHP-2结构域基因的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-SHP-1、pET-SHP-2,转化大肠杆菌BL21,在IPTG的诱导下成功表达相对分子质量大小约为37 500、40 100的融合蛋白,将纯化过的融合蛋白分别免疫小鼠,制备鼠源血清,采用间接ELISA和Western Blot试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12 800;Western Blot试验结果证明,制备的鼠抗pET-SHP-1、pET-SHP-2多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。采用硫酸铵盐析与DE-52离子交换层析相结合的方法提取并纯化血清得到纯度较高的鼠抗SHP-1、SHP-2抗体IgG。结果验证了Marc145细胞SHP-1、SHP-2的存在,克隆出了Marc145细胞SHP-1、SHP-2结构域基因并成功表达,为后续试验和研究奠定了基础。     

猪FcγRⅠ真核表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

本研究旨在建立稳定表达猪FcγRⅠ的Marc-145细胞系。从猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA,应用RT-PCR技术获得猪FcγRⅠ和γ链cDNA,并分别构建PIREShyg3-γ和pcDNA3.1-FcγRⅠ真核表达质粒;用脂质体共转染Marc-145细胞,经潮霉素B(300μg.mL-1)和G418(400μg.mL-1)共筛选获得稳定表达猪FcγRⅠ的细胞系;运用RT-PCR、玫瑰花环和流式细胞术对细胞系进行鉴定。结果表明成功构建了猪FcγRⅠ和γ链真核表达载体,建立了稳定表达猪FcγRⅠ的细胞系,且表达于转染细胞表面的poFcγRⅠ受体分子能与猪IgG特异结合。本研究为进一步研究奠定了基础。     

猪核糖核酸酶L基因真核表达载体的构建与表达

为了研究猪核糖核酸酶L(sRNase L)的抗病毒能力,利用pXJ41载体构建猪RNase L基因真核表达载体pXJ41-sRNase L,采用poly(I∶C)转染PK-15细胞刺激诱导sRNase L基因转录mRNA;根据Gen Bank上sRNase L基因编码区序列设计引物并加入真核表达增强序列Kozak序列,通过RT-PCR扩增sRNase L编码基因序列,并将其克隆至真核表达载体pXJ41,通过双酶切和测序鉴定重组质粒;将重组表达载体pXJ41-sRNase L转染Marc-145细胞,Western blot检测sRNase L在Marc-145细胞中表达。结果显示:成功扩增得到sRNase L基因全长;成功克隆至真核表达载体pXJ41并能够在Marc-145细胞中成功表达。结果表明:成功构建了真核表达载体pXJ41-sRNase L并在Marc-145细胞中实现了sRNase L的表达,为进一步研究sRNase L在猪体内先天性免疫中抗病毒能力及其机制提供了条件。     

猪γ干扰素的体外表达及其多克隆抗血清的制备

从健康仔猪前腔静脉无菌采血,分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,用猪γ干扰素(IFN-γ)基因特异性引物通过RT-PCR扩增猪IFN-γ的全长cDNA序列,将其克隆到pMD18-T载体中,再亚克隆到pUC18和表达载体pET-30a中,经测序发现其序列与GenBank报道的IFN-γ基因序列基本一致.将重组质粒pET-30a-IFN-γ转化大肠杆菌BL21,于37℃经IPTG诱导表达,IFN-γ基因获得表达,表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的39%.经SDS-PAGE及Westernblot分析表明,表达的融合蛋白分子量约为25 ku.将包涵体用8 mol/L脲变性,用ProBondTM Purification Systerm纯化,经透析复性,得到纯化的目的蛋白,含量可达0.3 mg/mL.将复性蛋白免疫新西兰白兔三次,制备了高滴度的猪IFN-γ抗血清.本实验表达和纯化了猪IFN-γ,并制备兔抗猪IFN-γ的抗血清,为下一阶段关于猪γ干扰素重组蛋白其应用奠定了基础.     

猪圆环病毒2型cap基因与猪γ-干扰素基因双表达载体的构建及稳定表达

通过PCR方法分别从含有猪圆环病毒2型(PCV-2)核衣壳蛋白(Cap)基因和猪,γ-干扰素(PoIFN-γ)基因的重组克隆载体pMD18-PCV-2Cap和pMD18-PoIFN-γ中扩增出Cap和PoIFN-γ的基因,将两基因亚克隆到真核表达载体pBudCE4.1中,构建重组真核双表达载体pBud-IFNPCV。重组质粒转染BHK-21细胞后进行Zeocin~(TM)抗性筛选建立细胞系,阳性细胞通过间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测cap和PoIFN-γ在BHK-21细胞中的表达。结果显示,试验中筛选出1株Zeocin~(TM)抗性阳性BHK-21细胞,cap和PoIFN-γ均在该细胞中获得稳定高效表达,这将为猪圆环病毒病的防治提供新的方法。