响应面法优化南极磷虾酶解液的脱氟工艺

[目的]利用响应面法对南极磷虾酶解液的脱氟工艺条件进行优化,为南极磷虾在食品工业中开发应用提供技术依据.[方法]在单因素试验的基础上,以脱氟率(Y)为响应值,选择醋酸钙添加量(A)、初始pH(B)、反应温度(C)为自变量,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究各自变量及其相互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响,并分析酶解液中主要营养成分的变化.[结果]建立二次回归方程:Y=84.94+2.75A+2.77B-2.31AC-9.70A2-8.90B2-3.20C2;醋酸钙添加量、初始pH及醋酸钙添加量与反应温度的交互作用对南极磷虾酶解液脱氟率的影响极显著(P<0.0l).南极磷虾酶解液脱氟工艺的最佳条件为:醋酸钙添加量21.5 mg/mL、初始pH 10.2、反应时间140 min、反应温度30.24℃,在此条件下的脱氟率为(84.15±1.37)%,与理论预测值(8537%)的相对误差较小.在最佳条件下脱氟后,酶解液中总氮和氨基态氮含量分别损失3.11%和2.52%,反应前后含量变化不显著(P>0.05).[结论]采用响应面法优化得到的南极磷虾酶解液脱氟工艺具有操作简单、对酶解液的营养成分影响较小等优点,有较高的可行性;建立的回归模型可用于实际预测.     

脱脂南极磷虾粉中降血糖与抗氧化肽的分离纯化与鉴定

食源性二肽基肽酶Ⅳ（Dipeptidyl peptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ）抑制肽和抗氧化肽分别有助于清除体内自由基和调节机体血糖。为实现脱脂南极磷虾粉的高值化利用,以及为糖尿病治疗寻找新方法,本研究从脱脂南极磷虾粉酶解产物中制备DPP-Ⅳ抑制肽和抗氧化肽段。使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶水解脱脂南极磷虾粉,探究时间与水解度、活性、产率的关系,并分离纯化多肽,最后通过分子对接确定抑制作用位点。结果表明,酶解液经超滤、Sephadex G15分离纯化和液相-质谱联用技术鉴定后,得到了4条具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化作用的肽,氨基酸序列分别为WPPLSPFRCPR、IPDWFLNRQ、FLWLKKTPLPL和DTVPWFPR。其中IPDWFLNRQ具备较高的DPP-Ⅳ抑制活性,DPP-Ⅳ抑制活性IC50值为（0.616±0.097）mmol/L;WPPLSPFRCPR具有较高的抗氧化活性,DPPH EC50值为（0.098 3±0.011） mmol/L,ABTS EC50值为（0.116±0.073） mmol/L。分子对接结果表明这4个肽主要通过氢键与DPP-Ⅳ活性中心及其以外的位点...     

抗肿瘤活性青蛤多肽的提取工艺研究

[目的]探究具有抗肿瘤活性的青蛤多肽的最佳提取工艺路线.[方法]选择胰蛋白酶酶解青蛤,以酶解液对PC-3细胞增殖抑制率（IR）为指标,研究料液比、温度、pH、加酶量和酶解时间对多肽提取率的影响,探讨最佳工艺,并采用超滤及G25洗脱分离纯化提取液.[结果]当温度为45℃、pH为7.0、料液比为1∶3、酶解时间为6h、加酶量为300 U/g时,分子量为3～5 kD青蛤提取液的抗肿瘤活性最好;分离纯化后在280 nm波长处得到3个峰,其中峰1和峰2成分抗肿瘤活性显著.[结论]以细胞增殖抑制率为指标可以确定青蛤多肽的提取及优化工艺路线.     

超滤对罗非鱼下脚料蛋白水解液分离特性的影响

通过对罗非鱼下脚料蛋白水解液经超滤处理,去除杂质和大分子物质,通过葡聚糖凝胶柱层析法测定其分子量,研究了超滤对水解液分离特性的影响.结果表明:超滤处理有效地截留原酶解液中的起浑物质起到了澄清作用,可以在透过液中保留原酶解液的鲜味和甜味,有效去除了腥味.超滤后的酶解产物中含有多肽混合物,其中58.30％的多肽分子量大于4 467,27.0％的多肽分子量介于759 ～4 467之间,小于759的肽占14.71％.表明超滤后的肽的分子量基本上是小于6 000的.酶解液中蛋白肽的分子量控制在6 000以下,有利于人体对多肽的消化吸收.     

羧肽酶A/B水解虾副产物制备ACE抑制肽

为了获得血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,使用α-胰凝乳蛋白酶对虾副产物进行预酶解,再选择羧肽酶A/B进行酶解,通过透析和凝胶层析纯化后,测定分离肽的ACE抑制活性。通过检测水解度,确定α-胰凝乳蛋白酶的最优水解时间为4h,羧肽酶A/B最优水解时间为6h。两步酶解产物的ACE半抑制浓度(IC50)值为6.39mg/mL。通过透析,得到500Da和500~1 000Da 2个抑制活性更高的组分,IC50分别为1.69和2.87mg/mL。进一步通过Sephadex G-15凝胶层析分离,得到4个IC50值小于0.2mg/mL的组分,其中组分F8最低,为0.134mg/mL,显示了较高的ACE抑制活性。该结果验证了羧肽酶A/B酶解可制备出高活性ACE抑制肽。     

北太平洋鱿鱼缠卵腺抗氧化酶解寡肽的制备

为探讨北太平洋鱿鱼(Todarodes pacificus)缠卵腺酶解寡肽的制备和抗氧化活性,以北太平洋鱿鱼缠卵腺为原料,选择碱性蛋白酶进行酶解,以水解度和DPPH自由基清除率为指标,经单因素和正交试验方法获得最佳酶解条件,超滤得到不同分子段多肽,通过测定还原能力、DPPH清除率、Fe~(2+)螯合能力、OH自由基清除率、超氧阴离子清除率评价不同分子量酶解多肽的抗氧化性,得出最佳分子段;采用琼脂糖凝胶G-25对最佳分子段进行分离,检测各峰对DPPH清除能力,得出最佳峰段后经HPLC进一步分离获得单一组分,由氨基酸测序仪进行N端降解测序得出目标肽序列。结果表明,碱性蛋白酶的酶解条件为温度50℃、酶解时间7 h、加酶量3 500 U/g、pH 9.0、料液比1∶6。经超滤得到的3～5 ku分子段抗氧化活性最强,经琼脂糖凝胶G-25分离得到3个峰,其中峰Ⅰ组分对DPPH清除率最好,当浓度为0.5 mg/m L时其DPPH的清除率为61.87%。经HPLC纯化得到单一峰,氨基酸序列测定为Ala-Tyr-Ala-Ser-Ser,相对分子质量为497.50。北太平洋鱿鱼缠卵腺酶解寡肽有较好的抗氧化活性。     

羊肚菌抗氧化肽的制备、纯化和鉴定

以羊肚菌蛋白为原料,采用超声辅助复合酶法制备抗氧化多肽,通过单因素和响应面实验确定抗氧化多肽的最佳制备工艺。结果表明,以DPPH自由基清除率为抗氧化指标确定制备羊肚菌抗氧化多肽的最佳制备工艺为:酶解时间60 min、酶解温度55.69℃,酶解p H值7.95,加酶量4 000 U/g;在此条件下得到的酶解多肽的DPPH自由基清除率最大,为89.09%。将所得多肽依次经过超滤、DEAE-32、Sephadex G-25筛选得到DPPH自由基清除率最高的多肽组分,其清除率达到96.71%,经质谱鉴定,其氨基酸序列为FPLIPGH。     

高速逆流色谱法分离制备南极磷虾虾粉抗氧化肽

采用复合蛋白酶酶解南极磷虾得到虾粉多肽,经超滤分离和高速逆流色谱技术进行分离纯化并检验其体外抗氧化活性。结果表明:经超滤分离后的多肽在分子量范围为5～10 ku时多肽抗氧化活性最好,当浓度为10 mg/m L时,其超氧阴离子自由基清除率达到21. 28%,DPPH自由基清除率为86. 52%,对羟基自由基清除率为53. 49%,Fe~(2+)螯合率为85. 35%。对分子量范围在5～10 ku的多肽进行高速逆流色谱分析,采用体积比为氯仿∶丁醇∶甲醇∶水=4∶0. 75∶3∶2作为两相溶剂体系,下相作固定相,上相作流动相;反转,转速900 r/min,恒温水浴温度为25℃,在流动相的流速1. 5 m L/min,进样浓度20 mg/m L的条件下分离得到5个组分。经测定:当浓度为5 mg/m L时,P3组分清除超氧阴离子自由基的能力和Fe~(2+)螯合能力均显著高于其余4个组分,分别为37. 18%和92. 33%,P2组分的DPPH自由基清除率最高,为90. 33%,P5组分的羟基自由基清除率最高,为70. 11%。与未经HSCCC分离的对照组相比,抗氧化活性均得到明显增强。     

响应面优化南极磷虾虾青素的复合酶法提取工艺研究

为加大对南极磷虾Euphausia superba高附加值产品的开发,提高南极磷虾资源的综合利用率,以冷冻南极磷虾为原料,采用Alcalase碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶复合酶解方法,以无水乙醇为提取剂提取虾青素,在单因素试验的基础上,以虾青素提取率为响应值,利用响应面优化设计,研究了虾青素的最佳提取工艺条件。结果表明:通过单因素试验筛选出酶底比、酶解时间和酶解温度为影响虾青素提取率的主要因素,优化得出最佳工艺条件为酶底比1.6%(Alcalase碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶比例为3∶2)、酶解时间2.1h、酶解温度51℃、水料比(m L∶g)4∶1、无水乙醇料液比(g∶m L)1∶4、振荡时间10 min,在此优化条件下虾青素提取率为90.42%±0.39%,与模型理论值接近。研究表明,采用双酶复合酶解法能显著提高南极磷虾虾青素的提取效率,可为南极磷虾虾青素的制备提供技术支持。     

超滤分离对虾头自溶产物ACE抑制活性的影响

采用3 000 u、5 000 u、8 000 u的超滤膜对凡纳滨对虾虾头自溶产物进行超滤分级分离,研究各组超滤组分的相对分子质量分布和氨基酸组成的变化,并比较各组超滤组分的血管紧张素转换酶（angiotensin I converting enzyme,ACE）抑制活性。结果表明：利用超滤膜分离虾头自溶液可提高虾头自溶产物的ACE抑制活性,3 000 u超滤组分的ACE抑制活性为0.61 mg/mL,活性居各超滤组分之首;8 000 u超滤膜有效载留了大部分大分子物质,相对分子质量小于3 000 u的多肽随超滤孔径的减小而增多;3 000 u超滤组分中芳香族氨基酸和支链氨基酸均高于其余各超滤组分。     

紫贻贝酶解多肽体外抗肿瘤活性研究

确定了紫贻贝胰蛋白酶水解时的最佳条件,研究了紫贻贝酶解多肽的体外抗肿瘤活性。采用正交实验方法,以料液比、pH、加酶量、酶解温度和酶解时间为因素,以酶解液的氨基氮含量和肿瘤细胞增殖抑制率为指标进行L16（45）正交实验,MTT法检测酶解多肽对DU-145、PC-3、H1299和MGC80-3等肿瘤细胞的抑制活性;HE染色法观察酶解多肽对肿瘤细胞形态的影响;免疫组化法检测酶解多肽对细胞中Bcl-2表达的影响。结果表明：当料液比为1：4、pH为8.5、加酶量为1 000 U/g、温度为45℃、酶解时间为5 h时酶解多肽的水解度最大;当料液比为1：4、pH为8.0、加酶量为1 500 U/g、温度为40℃、酶解时间为2 h时酶解多肽的抗肿瘤活性最强,该肽可以下调肿瘤细胞中Bcl-2的表达。紫贻贝酶解多肽具有抗肿瘤活性,可能是通过诱导细胞凋亡来实现的。     

不同蒸煮方式对南极磷虾粉虾青素含量的影响

[目的]研究有机溶剂法提取南极磷虾粉中虾青素的条件,并以虾青素为评价指标,探讨不同蒸煮方式对南极磷虾粉品质的影响,确定南极磷虾最佳蒸煮方式及工艺参数。[方法]以南极磷虾为原料,通过单因素试验及正交试验分析得到虾青素提取的最佳工艺条件;研究在不同蒸煮温度、时间条件下,直接水煮、隔水蒸煮、100℃水煮-直接水煮和100℃水煮-隔水蒸煮4种方式对虾青素含量的影响。[结果]虾青素的最佳提取条件为:无水乙醇为溶剂,浸提时间6 h、浸提温度50℃、料液比1∶20(g/m L);直接水煮、隔水蒸煮2种单一蒸煮方式在蒸煮温度70℃、蒸煮时间9 min时,所得虾粉的虾青素含量都达到最大值,且直接水煮的效果更好,虾青素含量达到221. 58μg/g;与单一方式蒸煮相比,组合方式蒸煮对虾青素含量的影响更小,南极磷虾的最佳组合方式是100℃水煮-直接水煮,蒸煮参数为第1次100℃直接水煮30 s,第2次50℃直接水煮9 min,最终得到虾粉的虾青素含量为253.16μg/g。[结论]该研究为南极磷虾粉生产中蒸煮加工提供理论依据。     

蜂胶和杨树胶中黄酮类成分及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

通过乙醇提取、液液萃取结合柱层析分离得到河南蜂胶和杨树胶中不同极性组分,利用高效液相色谱分析判定分离效果、确定分离成分;采用α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选模型评价各分离组分的体外降血糖活性;通过链脲佐菌素诱导的小鼠高血糖模型进行口服糖耐量实验,评价该分离组分体内抑制肠道内α-葡萄糖苷酶的功效。结果显示,蜂胶及其同源杨树胶的50%乙醇洗脱组分体外抑制α-葡萄糖苷酶效果最优,IC50值分别为39.03±2.76和28.28±3.79μg/mL,并能有效抑制糖尿病小鼠肠内α-葡萄糖苷酶活性,显著降低糖尿病小鼠的餐后血糖水平,有利于血糖水平恢复和保持血糖稳定;高效液相色谱分析结果发现,蜂胶及其同源杨树胶的50%乙醇洗脱组分中皆含有槲皮素、山奈酚、异鼠李素、芹菜素、白杨素和高良姜素等黄酮类化合物。     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

蚯蚓蛋白酶解工艺及其产物分析

采用Asl.398枯草蛋白酶制备蚯蚓肽,通过单因素与正交试验设计(L9(34)),以氨基氮数,多肽浓度为衡量指标,对最佳酶条件进行筛选研究,并分析了酶解液氨基酸含量和相对分子量的分布。结果表明:最佳酶解条件为pH 6.5、酶浓度为1%、温度50℃反应、时间8 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的水解液氨基氮数可以达到16.55 mmol/100 mL,水解液多肽浓度达9.22 mg/mL,酶解液分子量大部分是在5 000以下的多肽、小肽及氨基酸的混合物,其中分子量在220以下的占了72.09%,氨基酸组成平衡,含量丰富,可用来制取新型氨基酸微量元素及小肽添加剂。     

蚯蚓蛋白酶解工艺及其产物分析

采用Asl.398枯草蛋白酶制备蚯蚓肽,通过单因素与正交试验设计(L9(34)),以氨基氮数,多肽浓度为衡量指标,对最佳酶条件进行筛选研究,并分析了酶解液氨基酸含量和相对分子量的分布。结果表明:最佳酶解条件为pH 6.5、酶浓度为1%、温度50℃反应、时间8 h,在此条件下,酶解蚯蚓蛋白的水解液氨基氮数可以达到16.55 mmol/100 mL,水解液多肽浓度达9.22 mg/mL,酶解液分子量大部分是在5 000以下的多肽、小肽及氨基酸的混合物,其中分子量在220以下的占了72.09%,氨基酸组成平衡,含量丰富,可用来制取新型氨基酸微量元素及小肽添加剂。     

南极磷虾羧肽酶A的分离纯化及其酶学性质分析

[目的]建立南极磷虾羧肽酶A的分离纯化方法,并研究分析其酶学性质,为南极磷虾羧肽酶A的开发及应用打下基础.[方法]南极磷虾粗酶液经硫酸铵分级沉淀、HiTrap DEAE FF阴离子交换柱层析和SEC 70凝胶过滤柱层析,纯化得到的羧肽酶A,以SDS-PAGE分析其分子量;通过分析酶系反应温度、pH、金属离子、抑制剂对南极磷虾羧肽酶A活力的影响,明确其酶学性质和酶促动力学.[结果]南极磷虾羧肽酶A分子量为75.0 kD,其最适温度30℃,最适pH 8.0.Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ni2+对南极磷虾羧肽酶A有显著的激活作用(P<0.05,下同),且金属离子浓度越高,激活效果越明显;Ca2+、Fe3+、Cu2+和Hg2+对南极磷虾羧肽酶A存在不同程度的抑制作用,以Hg2+的抑制作用最强,Fe3+的抑制作用最弱.金属蛋白酶抑制剂乙二胺四乙酸(EDTA)、3-苯基丙酸(3-phenylpropionic acid)和1,10-菲罗啉(1,10-phen-athroline)对南极磷虾羧肽酶A活力有显著的抑制作用,且抑制剂浓度越高,抑制效果越明显.[结论]南极磷虾羧肽酶A具有金属蛋白酶特性,可开发成降解酶制剂在食品工业及医药行业中推广应用.     

中性蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽研究

以谷朊粉为原料,采用中性蛋白酶制备抗氧化多肽,并对其酶解工艺进行优化。结果表明,对中性蛋白酶酶解谷朊粉制备抗氧化多肽的影响顺序依次为酶解温度>加酶量>酶解时间;通过响应面分析优化酶解条件为底物浓度8%,加酶量2 800 U/g,温度52℃,时间280 min,此时酶解液羟自由基清除率达到65.3%,多肽含量为60.4 mg/mL。     

桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的影响

[目的]探讨桑茎的降血糖活性,为研究桑树的降血糖活性奠定理论基础。[方法]用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)法测定3种不同浓度的桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并用SPSS统计软件对测定结果进行显著性分析。[结果]10.326、0.653和103.264 mg/ml桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分别为1.03%、-2.40%和0,表明桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率低,抑制作用不明显。利用SPSS软件进行的显著性分析结果显示,3种浓度的桑茎浸提液在400 nm处的最终吸光值不存在显著差异,说明不同浓度的桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶的抑制率不存在显著差异。[结论]桑茎浸提液对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用不显著。     

碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化特性研究

采用碱性蛋白酶对核桃粕蛋白进行酶解,测定了不同酶解时间下的酶解液抗氧化性;用葡聚糖凝胶分离活性肽段并测定其抗氧化性。结果表明,酶解条件为酶用量3 000 U/g底物、底物质量浓度为40mg/mL、pH为8.5、温度为50℃下酶解210 min,酶解液的抗氧化活性较高,OH.清除率为72.3%,氧自由基清除率为83.1%,DPPH.清除率为102.6%,总抗氧化能力为162.986 U/mL;通过葡聚糖凝胶分离并与已知标准品对照表明碱性蛋白酶酶解核桃粕蛋白产物抗氧化活性多肽的分子量主要集中在1 321~607 u,该多肽片段对OH.清除率为70.23%,氧自由基清除率为62.57%,DPPH.清除率为99.56%,总抗氧化能力为118.987 U/mL。