表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性

利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。     

减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344株asd平衡致死系统的构建及其特性

为构建能稳定携带外源基因的减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344,本研究在减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaSL1344基础上,以χ7213（pREΔasd）为供体菌,ΔcrpΔcyaSL1344为受体菌,利用自杀性质粒介导的等位交换技术成功筛选出缺失编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶基因（aspartic semialdehyde dehydrogenase,asd）的ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株,进一步对其生物学特性进行初步研究。结果显示,其血清型和亲本株ΔcrpΔcyaSL1344及强毒株SL1344相同且该缺失菌株能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344相比有很大差异,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344基本一致,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力,其生长速度比强毒株更加缓慢。1日龄雏鸡攻毒试验表明ΔcrpΔcyaΔasdSL1344互补携带asd基因的pYA3493质粒后,ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA3493）毒力较强毒株SL1344降低了至少105倍,与亲本株ΔcrpΔcyaSL1344相比毒力仅相差10倍。结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344菌株构建成功,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。     

鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株AcrpAasd缺失株的构建及生物学特性初步研究

构建鼠伤寒沙门菌SL1344△cr户△nsd双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以Y7213（pREAasd）为供体菌,SL1344Acrp为受体菌进行结合转移,通过自杀性质粒介导的等位交换技术两步法筛选sI,1344的AcrpAasd双缺失株。该缺失株在有外源DAP的存在下能够正常生长,且能稳定遗传缺失的“sd基因;其血清型与亲本株SL1344Acrp及强毒株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相同,但与强毒株相比变化较明显,且生长速度明显减慢;雏鸡毒力试验结果表明其毒力较SL1344降低约10j倍。鼠伤寒沙门菌SL1344AcrpzSasd缺失株构建成功,为进一步开发以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定了基础。     

鸡肠炎沙门菌病及其抗性相关基因的研究进展

肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)是一种特殊的泛嗜性胞内病原菌,也是最为常见的食物源性病原菌之一,通过污染鸡蛋进行传播。肠炎沙门菌能导致成年鸡隐性感染且长期排菌,容易为生产所忽视;并且能在污染的鸡蛋中增殖,却不会引起蛋内结构明显的变化。肠炎沙门菌病不但对禽类生产造成的经济损失无法估量,而且对人类的身体健康也造成很严重的危害。宿主的遗传背景对肠炎沙门菌病的抗性有着深远的影响,探索抗性相关基因的遗传特性和差异表达规律是研究鸡对肠炎沙门菌病抗性的必要途径。本文对鸡肠炎沙门菌病的致病机理和抗性相关基因的研究进展进行了阐述,以期为鸡抗病育种研究提供借鉴。     

表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。     

重组减毒沙门菌在雏鸡体内的感染状况研究

为了检测能够表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组沙门菌在雏鸡体内主要组织和器官的感染情况,分别用亲本菌株和重组沙门菌免疫雏鸡,免疫后24~216 h每隔24 h对雏鸡的盲肠、血液、肝脏、脾脏、法氏囊中的细菌数量进行分析。结果显示:雏鸡接种重组减毒沙门菌后,其在血液中的数量不断升高并在96 h达到峰值,在脾脏中的数量不断升高并在120 h左右达到峰值,在肝脏、法氏囊中的数量不断升高并在168 h达到峰值,在盲肠中,细菌数量在不断升高并在72 h达到峰值;达到峰值后细菌数量逐渐下降。亲本菌株和重组菌株在相应组织器官中的数量变化趋势一致,但是亲本菌株的数量始终高于重组菌株。结果表明:重组菌株能在雏鸡体内生长定植,能为诱导雏鸡机体产生保护性免疫应答奠定重要基础,有望作为预防传染性法氏囊病毒的口服疫苗。     

减毒沙门菌介导的apo-tPA融合基因在鸡体组织的分布与表达

探讨以减毒沙门菌为载体,介导外源基因在动物体内的组织分布和表达的可行性。将编码人t-PA功能区的基因片段与鸡VLDLy组装前体apo-B100基因融合,定向克隆到荧光蛋白表达载体SV40启动子下游,构建pApo-tPA-GFP表达质粒。应用电转化法将pApo-tPA-GFP表达质粒转化减毒沙门菌,阳性减毒沙门菌经翅下静脉注入鸡体内,分别于注射后第1、2、3、4、5周随机剖检试验用鸡,无菌取内脏器官,经组织细菌培养、RT-PCR检测各脏器中基因分布,涂片荧光镜检基因表达情况。结果显示,在肝脏、脾脏和十二指肠均分离到沙门菌,PCR鉴定均为减毒沙门菌载体;RT-PCR检测在肝脏、脾脏、十二指肠中有目的基因存在;荧光检测在肝脏、脾脏中有荧光蛋白。结果表明,减毒沙门氏菌能够作为载体将目的基因有效的转入到动物体内,这一方法有望为动物转基因提供便捷、有效的途径。     

重组α1-giardin减毒沙门菌口服DNA疫苗的构建与鉴定

以贾第虫的c DNA作为模板,进行PCR扩增得到目的片段,克隆入p VAX1载体,构建重组质粒p VAX1-α1-giardin;以电击转化的方式转入减毒沙门菌株SL7207,构建重组沙门菌SL7207/p VAX1-α1-giardin;通过体外连续培养测定重组菌株的载体携带稳定性;30只清洁级雌性BALB/c小鼠,随机分为3组,每组10只,分别以1×106的SL7207/p VAX1-α-giardin、SL7207/p VAX1和无菌1×PBS(p H 7.0)口服免疫小鼠,8周后处死,检测各组小鼠肠系膜淋巴结中α1-giardin的表达及血清中和小肠灌洗液中特异性Ig G和SIg A的水平。结果表明,重组减毒沙门菌SL7207/p VAX1-α1-giardin连续培养168 h后,质粒携带率为90%;口服免疫小鼠8周后,SL7207/p VAX1-α1-Giardin免疫组,肠系膜淋巴结可见α1-Giardin的高表达,血清中特异性Ig G抗体水平和小肠灌洗液中特异性SIg A水平均明显增高,分别为PBS组的3.6(P0.01)和5.7倍(P0.01)。本研究尝试了以减毒沙门菌为载体携带α1-giardin DNA的抗贾第虫口服疫苗的构建及免疫试验,为进一步的疫苗保护性试验和制剂研究奠定了基础。     

重组减毒沙门菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在BHK细胞中的表达及活性检测

为了探讨原核表达质粒中的真核基因在减毒沙门菌中表达的多肽是否能在真核细胞中加工修饰成具有生物活性的蛋白,试验根据人t-PA的编码序列设计1对引物,扩增t-PA目的基因片段,构建pET28-tPA原核表达质粒,将表达质粒电转化导入减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpSL1344中并转染BHK细胞,应用SDS-PAGE技术检测t-PA表达情况,ELISA法检测其表达水平,琼脂糖平板溶圈法检测纤溶活性。结果表明:重组菌ΔcrpSL1344(pET28-tPA)在BHK细胞中有66.0 ku的蛋白表达,转染96 h的表达量为108μg/L,细胞裂解液和转染表达质粒的细胞培养上清液均有促纤溶活性。说明携带t-PA原核表达质粒的减毒沙门菌具有较强的促纤溶活性。     

携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性

将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB.将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达.质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性.动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P＜0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P＜0.01).上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础.     

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H₂S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H₂S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A...     

表达IBDV VP2蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建及免疫原性分析

通过PCR克隆出IBDV VP2基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-VP2。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（缺失Asd、Cya、Crp基因）,获得重组疫苗菌株X4550（pYA3341-VP2）。进行重组菌VP2蛋白表达的鉴定;测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性以及小鼠免疫试验。结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE和Western blot证实重组菌表达的VP2蛋白能与鸡抗IBDV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;口服重组菌免疫小鼠,ELISA检测产生了抗IBDV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。本试验成功构建了能稳定表达IBDV VP2蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550（pYA3341-VP2）,为研究IBD口服基因工程疫苗奠定了基础。     

减毒猪霍乱沙门菌C500作为基因疫苗运载体的研究现状

基因疫苗具有众多的优点,被誉为疫苗研究的第3次革命,但是在畜牧生产的使用中存在系列亟待解决的问题,其中关键的问题就是如何将基因疫苗表达质粒导入到动物机体免疫细胞,减毒胞内寄生菌的应用很好的解决这一问题.目前我国仔猪副伤寒弱毒活疫苗使用的基本都是C500株,以其作为猪群重要传染病基因疫苗运载体的应用研究具有重要临床应用价值,对猪霍乱沙门菌疫苗株C500作为基因疫苗运载体的研究现状予以概述.     

减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究

为研制能够稳定携带外源基因的猪霍乱沙门菌口服活疫苗载体,本研究在减毒猪霍乱沙门菌△cyaC78-1基础上,利用自杀性质粒介导的等位交换技术,构建了△cya△asdC78-1宿主-载体平衡致死系统,并对其生物学特性进行了鉴定。PCR及测序结果表明△cya△asdC78-1构建正确,其生物学特性检测结果显示△cya△asdC78-1生化特性与△cyaC78-1完全相同,血清型与△cyaC78-1和疫苗株C500相同,并且具有稳定的遗传特性;其生长速度与△cya C78-1基本相同,均明显慢于疫苗株C500。动物试验表明△cya△asdC78-1电转化携带asd基因的互补质粒pYA3493后,其毒力比△crp△asdC78-1(p YA3493)降低1.14倍,比△asdC500(pYA3493)降低了5.1倍。以上结果表明,减毒猪霍乱沙门菌△cya△asdC78-1同样可以作为口服活疫苗载体用于高效表达外源基因,为开发以C78-1为基础的口服多价疫苗载体奠定了基础。     

三株递呈猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的生物学特性研究

为了探究减毒沙门菌递呈不同长度猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因的可行性,本研究对3株携带不同长度S基因片段的减毒鼠伤寒沙门菌进行了生物学特性评估。主要进行了对所构建的重组减毒沙门菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(长456bp,编码S蛋白N末端499—650位氨基酸)、SL7207(pVAX-S499-789)(长873bp,编码S蛋白N末端499—789位氨基酸)和前期构建的菌株SL7207(pVAXD-S1-789)(长2 367bp,编码S蛋白N末端1—789位氨基酸)的生物学特性研究,包括生长曲线测定、携带质粒的体内/外稳定性、回肠组织内的转录、在小鼠体内动态增殖规律、小鼠口服的安全性等。结果表明:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXDS1-789)3种口服菌株均具有较高的稳定性;携带的目的基因可在肠道组织内转录;菌株在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除;小鼠口服具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门菌SL7207可递呈不同长度的S基因抗原片段,为后续开展3种菌株的实际口服免疫效果比较研究奠定了基础。     

禽源肠炎沙门菌aroA基因缺失株的构建及其生物学特性研究

试验旨在研究aroA基因对肠炎沙门菌生物学特性及毒力的影响。利用λ-Red同源重组技术,将从田间分离的禽源肠炎沙门菌的aroA基因进行敲除,经连续传代检测缺失株遗传稳定性,并通过细菌生长曲线、对不同生化反应管的利用情况、生物膜形成能力、对环境应激的抵抗能力及对1日龄雏鸡的毒力比较野生株和基因缺失株之间的差异。结果显示,试验成功构建缺失株,连续传30代未发现目的基因回复突变;在相同培养条件下,缺失株与野生株在相同时间进入对数生长期和稳定期,但缺失株生长速率低于亲本株;缺失株较野生株生化特性未发生改变;缺失株的生物膜形成能力及对酸、碱、高渗和热应激的抵抗能力均显著低于野生株（P<0.05）;1日龄雏鸡分别滴口接种缺失株和野生株,观察14 d,野生株组鸡全部死亡,而缺失株组无死亡。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的肠炎沙门菌aroA基因缺失株,缺失株生化特性和体外生长趋势未发生明显改变,但生物膜形成能力、对环境应激抵抗能力及毒力均明显下降。本研究为进一步研究肠炎沙门菌aroA基因缺失株的免疫原性奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌prfA基因重组菌的构建及其生物学特性研究

为制备单核细胞增生李斯特菌(LM)减毒的prfA基因重组菌,本研究通过构建重组质粒pKSV7-ΔprfA-gfp,电转化至LM TA感受态细胞中,将绿色荧光蛋白基因gfp插入LM的prfA基因第25 bp～93 bp之间,在42℃和10μg/mL氯霉素的双重选择压力下,筛选LM重组菌(rLM-ΔprfA-gfp),并对其生物学特性进行鉴定。试验结果表明,重组菌与亲本菌相比具有相似的体外生长特性,溶血素基因(hly)mRNA的转录水平降低;对小鼠的毒力显著减弱,其LD50由105.53升高到109.79,对肝、脾、肾的损伤不明显;免疫保护力试验显示重组菌与LM TA灭活疫苗的保护率分别为90%和35%,表明rLM-ΔprfA-gfp比传统疫苗具有更高的保护力。本研究构建的rLM-ΔprfA-gfp具有良好的遗传稳定性,并且具有较好的免疫原性,为LM活疫苗载体和分子标记疫苗的研制奠定了基础。     

肠炎沙门菌icdA基因缺失株的构建及重要特性分析

为研究肠炎沙门菌异柠檬酸脱氢酶(IDH)的功能,本研究利用λ-Red重组技术构建了肠炎沙门菌IDH编码基因icdA缺失突变株c50336ΔicdA,对其进行生长和生化特性检测,并通过体外模拟应激试验、药敏试验、生物被膜检测、抗蛋清杀伤、胞内存活和动物感染实验,分析icdA基因在肠炎沙门菌致病机制中的重要作用。研究结果显示,icdA基因缺失不影响肠炎沙门菌的生长特性和生化特性,在热应激(42℃)、酸应激(pH3.5)和高渗应激(NaCl2.4mol/L)条件下其存活率也未出现显著变化,但icdA基因缺失能够显著降低肠炎沙门菌对碱、低渗透压和过氧化氢应激的抵御能力,降低肠炎沙门菌对多粘菌素B的耐药性和生物被膜的形成能力;同时,该基因缺失能够降低肠炎沙门菌对蛋清杀伤的防御能力、在巨噬细胞内的存活能力和其对小鼠的毒力。研究结果表明icdA基因参与肠炎沙门菌的抗应激能力、耐药性、生物被膜形成和抗蛋清杀伤能力,从而影响细菌的毒力。本研究为肠炎沙门菌疫苗的研究奠定了重要基础。     

禽用减毒沙门菌活载体疫苗的研究进展

疫苗主要通过激发机体的免疫系统来达到防治疾病的目的。目前,疫苗主要有灭活疫苗、减毒疫苗及基因工程疫苗等。基因工程疫苗包括基因缺失苗、基因重组苗等。活载体疫苗是将胞内感染性的细菌直接用来运载目的基因进入体内,而产生相应的免疫应答反应。目前沙门菌的预防与治疗通常使用药物,但沙门疫苗研究正迅速发展,如减毒沙门菌活载体疫苗则是将减毒后的沙门菌作为载体,