猪IL-10的原核表达及其单克隆抗体的制备

为了制备猪IL-10的单克隆抗体(MAb),本研究根据GenBank登录的猪白细胞介素10(PIL-10)基因序列设计两对特异性引物,利用套式PCR扩增PIL-10成熟蛋白编码基因(490bp),构建原核表达载体pET28a-PIL-10,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和western blot分析鉴定,证明PIL-10重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌抗猪IL-10MAb的杂交瘤细胞,将其命名为2F4。Western blot结果证明该MAb能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为1∶1024,腹水效价为1∶128000,该MAb为IgG3亚型,轻链为λ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪IL-10的检测方法奠定了物质基础。     

抗鸡β干扰素单克隆抗体的制备及初步鉴定

以鸡β干扰素（IFN-β）的重组蛋白pCold-ChIFN-β免疫8周龄Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗鸡β干扰素单克隆抗体,获得两株抗鸡IFN-β的单克隆抗体。经ELISA鉴定,两株单抗的腹水效价均达到10-3以上;Western blot检测结果证明2株单克隆抗体均能与表达的鸡IFN-β发生特异性反应;其中一株单抗可检测浓度小于15 pg/mL的鸡IFN-β。本研究为检测鸡IFN-β提供了一种重要工具,也为评价鸡用疫苗的免疫效果等奠定了物质基础。     

禽呼肠孤病毒(ARV)p10蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了深入研究禽呼肠孤病毒(ARV)的致病机理,从其基因组中克隆病毒非结构蛋白p10基因,并将其与原核表达载体连接,转入大肠杆菌BL21中,使其表达携带His标签的p10融合蛋白,经镍柱纯化得到高纯度重组p10蛋白,以该蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,经过3次亚克隆后获得2株能够稳定分泌针对p10蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为2B12与4H10。通过间接ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)方法测定其腹水效价均为1:1.01×10~7,亲合力解离常数(kD)分别为3.91×10~(-10)、5.75×10~(-10),2株单抗的IgG亚型均为IgG2b。经Western Blot鉴定,该2株抗体均能特异性识别ARV感染DF-1细胞中的p10蛋白。这些单抗的制备为深入研究ARV的致病机理奠定了基础。     

禽IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽源IL-2的单克隆抗体,首先构建chIL-2的原核表达载体并进行表达,用HIS-IL-2蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取小鼠脾与骨髓瘤细胞sp2/0融合,应用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤,最终获得3株稳定分泌chIL-2抗体的杂交瘤,分别命名为1C2,2F2和4B5。并对所获得单抗的特性进行了鉴定,结果表明,3株单抗亚型均为IgG1,抗体亲和力解离常数(K_d)分别为4.81×10~(-10)、1.36×10~(-10)、4.15×10~(-9),均为高亲和力抗体,经过Western Blot确定3株单抗分别识别chIL-2的不同区域,且均能特异性识别chIL-2。该单抗的制备为chIL-2的功能研究和应用奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备CIAV VP2单克隆抗体,将原核表达的His-VP2融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将原核表达的GST-VP2融合蛋白作为包被抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗CIAV VP2蛋白的杂交瘤细胞克隆,分别命名为3D7、3B8、2D3。经间接ELISA测定,以上3株杂交瘤细胞腹水效价分别为1:8.0×10~5、1:4.0×10~5,以及1:6.4×10~6,亲和力解离常数分别为7.34×10~(-11)、2.65×10~(-11),以及2.98×10~(-11)。IgG亚类分别为IgG1、IgG2b以及IgG2b。经Western Blot试验证明,3D7株单抗能特异地识别CIAV VP2蛋白,其识别的抗原表位区域为VP2 N-端的20~40 aa。经IFA试验证明,3株单抗均能识别天然的CIAVVP2蛋白。此单抗为研究CIAVVP2的生物学功能和CIAV致病机理奠定基础。     

鸡Mx蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用.为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株.间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间.Westem blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应.本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础.     

鸡白介素18基因原核表达质粒构建

根据已发表的江西土鸡白介素 -1 8(Ch IL-1 8) c DNA编码基因序列设计引物 ,用PCR技术从 p MDCh IL-1 8质粒扩增出编码鸡IL-1 8成熟蛋白基因 ,重组于 p BV2 2 0表达载体上 ,将重组质粒转化大肠杆菌 JM1 0 9(DE3 ) ,转化子经温度诱导的表达产物 ,SDS-PAGE电泳鉴定约 2万 ,N端开头 1 5个氨基酸序列测定分析 ,证明获得了鸡 IL-1 8成熟蛋白 ,为今后深入研究鸡 IL -1 8的生物学特性及其临床应用打下了基础     

山羊IL-9基因克隆表达与单克隆抗体的制备

为了研究捻转血矛线虫诱导山羊产生Th9型免疫应答的特点,制备了抗山羊IL-9单克隆抗体。采用基因克隆、表达和纯化得到重组蛋白IL-9,并以重组IL-9为免疫原,重组蛋白IL-9和His-tag为筛选抗原,通过杂交瘤细胞技术,筛出1株稳定分泌抗山羊IL-9单克隆抗体细胞株,命名为6A11A8。将该细胞株接种小鼠腹腔,制备腹水,并将纯化后的抗体与生物素耦合,用流式细胞术检测山羊外周血单核细胞(PBMCs)中表达IL-9的细胞亚类。结果显示:融合蛋白大小约为16 ku,主要分布于包涵体中,筛选出的6A11A8细胞株产生的抗体效价高、特异性强,其细胞上清抗体效价可达1∶2430,其抗体亚型为IgG2bκ,层析柱纯化小鼠腹水后其效价可达1∶512 000,该单抗可识别山羊PBMCs中分泌IL-9的亚类细胞。结论:本研究获得了山羊IL-9单克隆抗体,为研究山羊Th9型免疫反应奠定了基础。     

抗鹅星状病毒Cap蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

自2016年以来,鹅星状病毒(GoAstV)已成为当前危害鹅养殖业生产的重要病原体之一,雏鹅均易感,主要引起9～19日龄雏鹅死亡,以雏鹅腿关节肿胀及肾脏尿酸盐沉积导致肾炎为主要病征.建立相应的病原学与血清学检测方法对于防控该病至关重要.为建立基于病毒Cap蛋白的诊断技术,本研究构建了鹅星状病毒去核定位信号肽的Cap基因...     

DNA免疫法制备抗鸡IL-4单克隆抗体

为建立有效检测鸡IL-4(ChIL-4)的生物学方法,将重组真核表达质粒pVAX1-ChIL-4作为免疫抗原,肌肉注射法免疫6周龄BALB/c小鼠,免疫的间隔时间为4周,共免疫5次;于加强免疫3次后,取免疫鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以His-ChIL-4为检测抗原,建立间接ELISA筛选杂交瘤细胞株;采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞株进行亚克隆,体内诱生腹水法大量制备腹水单抗;采用ELISA、Western blot法分析mAbs的特异性。结果本研究共获得3株抗ChIL-4mAbs:1C11、5C1和3E10,其亚类分别为IgM、IgM和IgG2a,腹水效价为(1.6~6.4)×104。间接ELISA及Western blot结果显示,所获得的mAbs均只识别重组ChIL-4,而不能识别其他无关抗原,表明所获得的3株mAbs均特异性针对ChIL-4。该mAbs的获得为建立检测ChIL-4的生物学方法及进一步研究ChIL-4的生物学功能提供了有效的生物材料。     

鸡白细胞介素2分子单克隆抗体的研制

以含有鸡白细胞介素2（ChlL-2）基因的重组真核表达质粒pcDNA3．1-ChlL-2免疫6周龄BALB／c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。共获得2株特异性分泌抗鸡IL-2分子的杂交瘤细胞株,分别命名为1H10和1E6,其腹水ELISA效价分别为1：6400和1：3200,亚类鉴定结果均为IgM。重组质粒pcDNA3．1-ChlL-2转染COS-7细胞,以上述单克隆抗体（mAb）检测表达产物,结果表明,2株mAb均能与表达产物反应;Western blot分析结果显示,2株mAb均与原核表达鸡IL-2蛋白发生特异性反应。本研究所制备的抗鸡IL-2分子mAb可为建立简单、快速的鸡IL-2检测方法提供可能,并为鸡IL-2生物学特性和禽类细胞免疫机理的研究提供材料。     

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白（BSA）偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10.生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度（IC50）为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立.     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

流行性乙型脑炎病毒(JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白。本研究利用原核表达的乙型脑炎病毒SA14-14-2株结构蛋白E蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术进行融合,经有限稀释法获得1株特异性针对JEV E蛋白的杂交瘤细胞,命名为5D4,经测定5D4单抗亚类属于IgG2a,轻链为κ链。经Western blot证实所得杂交瘤细胞分泌的抗体可特异地与JEV E蛋白结合。结果表明,所制备的抗JEV E蛋白的单抗对病原检测具有很高的特异性,为JEV准确快速的病原诊断和JEV感染相关的基础性研究提供了物质基础。     

阿维菌素类药物单克隆抗体的制备和鉴定

将阿维菌素与牛血清白蛋白偶联,免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术获得了1株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株。用间接ELISA测定腹水的效价为1：160000,抗体的50％抑制药物浓度（IC50）为2．5ng／ml,抗体与伊维菌素的交叉反应为12．5％,与多拉菌素、莫西菌素均无交叉反应。     

鸭肠炎病毒VP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

应用截短表达的鸭肠炎病毒(DEV) VP5-C蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合及筛选,获得4株稳定分泌抗VP5蛋白的杂交瘤细胞株,命名为1B5、3A1、4F9、6F6.抗体亚类鉴定表明,4株单克隆抗体均为IgG、k链.间接免疫荧光检测结果表明,4株单克隆抗体均能够与DEV感染CEF发生特异性反应,而不与CEF对照发生反应.Western blot检测,4株单克隆抗体均能够识别大小约为150 kDa的蛋白,说明4株单抗隆抗体是特异性识别VP5蛋白的抗体.DEV VP5蛋白单克隆抗体的制备为进一步鉴定VP5蛋白B细胞抗原表位及VP5蛋白功能研究提供了有效工具.     

鸭肝炎病毒单克隆抗体的研制

以反复冻融、氯仿处理、滤膜过滤、PEG反透析浓缩和分子筛层析的方法纯化DHV免疫BALB／c小鼠，同时作为包被抗原建立了筛选抗DHV阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA方法，经特异性和重复性试验，效果良好。经一系列融合、筛选，成功获得阳性杂交瘤细胞株4株，并制备出了腹水，分别命名为285、2E8、5E6和6C11。特性鉴定结果表明4株单抗ELISA效价均比较高且特异性好，中和特性稍差，和两株Ⅰ型标准毒以及在山东分离到的几株病毒均有交叉反应。     

磺胺二甲嘧啶单克隆抗体的制备及特性鉴定

采用重氮化法合成磺胺二甲嘧啶(SM_2)-人血清白蛋白(HSA)免疫抗原和SM_2~-卵清白蛋白(OVA)包被抗原。经紫外光谱扫描法确认SM_2与载体蛋白偶联成功；经计算SM_2与HSA、OVA的结合比分别为9：1和15：1。利用杂交瘤技术和有限稀释法经过5次亚克隆,得到三株特异性稳定分泌SM_2抗体的杂交瘤细胞,经鉴定该单克隆抗体免疫球蛋白亚类为IgG_1,为入链,分子量为162Ku,染色体数目90条左右,亲和常数为6．1×10~(12)M~(-1)。与其他四种磺胺药和两种载体蛋白HSA、OVA均无交叉反应。