秦岭野鸟源新城疫病毒致病性与F、HN基因分子特征分析

为研究新城疫病毒(NDV)在秦岭地区野生鸟群中的流行情况,在秦岭地区采集健康野鸟咽喉、泄殖腔拭子各252份,进行NDV的分离、鉴定,并对NDV分离株进行生物学特性研究和遗传进化分析。结果共分离获得5株野鸟源NDV,其致病指数MDT、ICPI和IVPI分别为60.0～76.8h、0.900～1.261、0.41～0.81;对F基因(47～420bp)进行遗传进化分析,5株分离株均属于基因VIb型,F蛋白裂解位点为112 RRQKRF117;HN基因氨基酸相似性为99.5%～99.8%,与鸽源基因VI型NDV相似性为91.4%～98.0%,与LaSota、F48E9相似性分别为87.1%～87.4%、89.0%～89.3%。上述结果表明,基因VIb型NDV在秦岭地区健康野生鸟类中流行,可能源于鸽源NDV,并具有强毒力的分子特征,但对鸡的表现为中等致病力,说明野鸟NDV具有独特的分子特征和致病性。     

广东地区8株鹅源基因Ⅻ型新城疫病毒F蛋白基因遗传进化分析

为了解当前广东地区鹅群新城疫病毒(NDV)遗传进化情况,本研究从广东养殖病死鹅组织样品中分离鉴定获得8株NDV,对分离株的F蛋白基因进行核苷酸及氨基酸序列分析。8株分离病毒之间F蛋白基因同源性较高,为96.3%-99.9%,但与当前国内NDV优势流行株及疫苗株同源性均较低。遗传进化分析结果显示所有新分离株均属于Ⅻ型NDVⅫb亚型分支,而当前国内NDV的优势流行株及常用疫苗株均属于Ⅶd亚型分支。氨基酸序列分析结果显示,本研究分离株F蛋白裂解位点氨基酸序列均为~(112)K/RRQKR/F~(117),符合强毒株分子特征;与基因Ⅶ型代表株NDV/ZJ1相比,新分离株F蛋白B细胞中和抗原表位均出现D~(170)N变异;而与2010年～2011年报道的广东Ⅻb亚型分离株相比,新分离株F蛋白疏水区、七肽重复序列等区域均出现氨基酸的变异。综上所述,本研究分离鉴定的8株鹅源NDV的F基因均属于Ⅻb亚型,与Ⅶd亚型流行株及常用疫苗株F基因同源性较低,且其多个氨基酸关键位点存在变异。本研究在国内首次从病死鹅体内分离到基因Ⅻ型NDV,为进一步了解基因Ⅻ型NDV在广东地区水禽中的流行、病原进化以及疫苗株更新提供参考。     

鸽源新城疫强毒株的分离鉴定及F基因序列分析

选取发病死亡的鸽群中疑似新城疫(ND)的病例,并进行了病原的分离与鉴定,从中分离出3株鸽源新城疫病毒(NDV),并对分离到的NDV进行了F基因序列测定和遗传变异分析,通过绘制系统进化发生树确定了3株鸽源新城疫病毒均为基因Ⅵb亚型。其裂解位点序列均为112RRQKRF117,根据其分子特征符合鸡NDV强毒范畴,但MDT、ICPI、IVPI的结果均显示这3株病毒对鸡的致病力较弱,属于中等偏弱毒株。当前鸡群中流行的基因Ⅶ型病毒裂解位点与鸽分离株的完全相同,而基因Ⅶ型对鸡却呈高致病性,说明F基因裂解位点序列并不是决定NDV毒力的唯一因素,推测其它基因可能在鸽源NDV致病性中起到了关键性的作用。     

六株鸽源新城疫病毒的分离、鉴定及生物信息学分析

新城疫是严重危害世界养禽业的一种禽类传染病。近年来,鸽新城疫的流行越来越严重,引起了养殖户和兽医工作者的广泛关注。本研究在4批发病鸽组织病料中分离到了4株鸽源新城疫强毒株和2株鸽源弱毒株。病毒分离株经鸡胚有限稀释法纯化5次后,新鲜尿囊液用于提取病毒RNA。经RT-PCR扩增、测序得到分离株的F基因和HN基因序列。通过对F基因的遗传进化分析发现,4株鸽源强毒株属于ClassⅡ基因Ⅵb亚型,2株鸽源弱毒株与Class II基因II型疫苗株La Sota高度同源。进一步遗传进化分析结果显示,4株鸽源新城疫病毒强毒株与目前国内流行株属于同一遗传分支,这些毒株与欧洲流行株亲缘关系十分相近,而与中国20世纪90年代鸽源分离株遗传距离稍远,因此推测当前鸽源流行强毒株可能源自欧洲。生物信息学分析显示鸽源毒株HN蛋白345~353位的一个线性抗原表位发生了改变,而血清学实验显示La Sota疫苗株和鸽源毒株的交叉血凝抑制存在明显差异,暗示鸽源毒株已经发生了抗原性变异。因此,使用鸡疫苗株La Sota免疫鸽存在免疫失败的风险,需要研发鸽专用新城疫病毒疫苗用于鸽新城疫的防疫工作。     

2018〜2019年我国部分地区新城疫病毒的F基因序列分析

本研究自2018-2019年从疑似感染新城疫的家禽病料分离鉴定出13株新城疫病毒(Newcastle disease viruses,NDV),采用RT-PCR方法对这13株NDV分离株的F基因进行扩增,产物经TA克隆并测序后与GenBank数据库中的参考毒株进行遗传进化分析。结果显示,其中的7株属于基因Ⅱ型,5株属于基因VI型,1株属于ClassⅠ亚型。F基因相似性分析结果显示,7株基因Ⅱ型毒株与疫苗株La Sota.Bl sClone 30的核昔酸相似性在9&1%-100%之间,氨基酸的相似性在97.6%~100%之间。5株基因VI型分离株与Ⅱ、Ⅶ型疫苗株及VIb亚型代表株之间的核昔酸相似性在79.7%-98.4%之间,氨基酸的相似性在76.6%-97.6%之间。1株基因Ⅰ型的分离株与Ⅱ,Ⅶ型疫苗株及Class Ⅰ代表毒株的核昔酸相似性在52.1%-97.3%之间,氨基酸的相似性在68.5%-96.8%之间,表明当前部分地区的NDV分离株与传统疫苗株之间存在较明显的遗传特征差异。     

鹭源新城疫病毒的生物学与遗传学特性研究

对2013年从健康野生鹭科候鸟中分离的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)蚀斑纯化后,选择5株病毒进行了生物学鉴定和遗传进化分析。致病指数和脑内接种指数测定结果显示5个分离株均为弱毒株;F蛋白裂解位点处氨基酸序列均为112ERQERL117,具有典型的弱毒株特征。交叉HI试验结果发现ClassⅠ分离株与La Sota的HI抗原同源性为0.56~0.57,与ClassⅡ强毒株的HI抗原同源性为0.44~0.51;遗传进化分析发现5个NDV毒株与目前流行的强毒株遗传关系较远,均属于ClassⅠ3c亚型,表明健康鹭携带I类新城疫病毒,在迁飞的过程可能传播给家养水禽,对其构成潜在威胁,提示加强野鸟NDV的监控及流行病学研究具有紧迫性和重要性。     

5株禽新城疫病毒新疆分离株F基因序列测定与遗传进化分析

从新疆乌鲁木齐市郊区养禽场发病禽群中分离到4株鸡源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)和1株鸽源NDV.经血凝HA试验鉴定,NDv分离株均具有血凝性,5个毒株的血凝特性均口J被NDV阳性血清所抑制.而不能被禽流感病毒(H5亚型与H9亚型)阳性血清抑制.本试验通过RT-PCR扩增了5株NDV全长F基因并进行了序列测定.序列分析表明,5株NDV的核苷酸序列分别为1662、1589、1676、1589和1662 bp,均含有1个开放阅读框,分别编码553、528、553、520和553个氨基酸;根据基因裂解位点的氨基酸序列分析表明.鸡源XJ/10/08株属于强毒株.XJ/3/07株、XJ/7/07株、XJ/9/08株和XJ/11/08株属于弱毒株;同源性分析表明,5个NDV新疆分离株与La Sota疫苗株的核苷酸同源性在83.7%～99.8%之间,与TaiWan95株核苷酸同源性在84.7%～93.3%之间;遗传发育进化树分析表明,分离到的4个弱毒株与La-Sota、Clone30、B1、BEA-45在同一亚群,属基因Ⅱ型,强毒分离株与TaiWan95、广东株(GD-1-98)、江苏株(JS-5-1)在同一进化分支内,属基因Ⅶ型.     

10株广西野鸟源新城疫病毒HN基因的遗传进化分析

对分离自广西4种鸟类的10株新城疫病毒(NDV)分离株,进行HN基因的RT-PCR扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西野鸟源NDV HN基因的分子进化特征,为科学防控新城疫提供依据。结果显示,10株广西野鸟源NDV分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,2株鹧鸪源NDV分离株与NDV基因XII型同源性高达98.0%～98.1%, 5株斑鸠源和3株鸽子源NDV病毒与NDV基因VI型的同源性高达90.0%～91.9%。遗传进化分析显示,10株广西野鸟NDV分离株与我国经典强毒株F48E9、弱毒疫苗株LaSota和基因VII型NDV(我国目前应用最广的疫苗株基因型)遗传距离较远。     

华东某活禽市场新城疫病毒和低致病性禽流感病毒的初步分离与鉴定

为了解春季活禽市场新城疫病毒(NDV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)的携带情况,2016年3~4月采集华东某活禽市场健康家禽的泄殖腔新鲜棉拭样品100份(鸡源样品40份,鸭源28份,鹅源32份)。以鸡胚接种方法分离病毒,接种后5 d收集鸡胚尿囊液用于血凝试验,共获得7株具有HA活性的病毒,均来源于水禽。采用双重RT-PCR对分离毒株进行鉴定,同时对NDV的F基因和AIV的M基因进行扩增,并对扩增的测序进行分析。结果显示:从样品中分离到NDV 4株,为ClassⅠ系列毒株;分离到AIV 3株,M基因遗传演化分析显示,其中2株病毒与国内流行的H6亚型AIV遗传关系较近,另外1株病毒与国内流行的H9亚型AIV毒株遗传关系较近。     

5株禽新城疫病毒新疆分离株F基因序列测定与遗传进化分析

从新疆乌鲁木齐市郊区养禽场发病禽群中分离到4株鸡源新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）和1株鸽源 NDV。经血凝HA试验鉴定,NDV分离株均具有血凝性,5个毒株的血凝特性均可被NDV阳性血清所抑制,而不能被禽流感病毒(H5亚型与H9亚型)阳性血清抑制。本试验通过RT-PCR扩增了5株NDV全长F基因并进行了序列测定。序列分析表明,5 株 NDV 的核苷酸序列分别为1662、1589、1676、1589和1662 bp,均含有1个开放阅读框,分別编码 553、528、553、520 和 553个氨基酸;根据基因裂解位点的氨基酸序列分析表明,鸡源XJ/10/08株属于强毒株, XJ/3/07株、XJ/7/07株、XJ/9/08株和XJ/11/08株属于弱毒株;同源性分析表明,5 个 NDV新疆分离株与 La Sota 疫苗株的核苷酸同源性在 83.7%～99.8% 之间,与 TaiWan95 株核苷酸同源性在 84.7%～93.3% 之间;遗传发育进化树分析表明, 分离到的4个弱毒株与LaSota、Clone30、B1、BEA-45在同一亚群,属基因Ⅱ型,强毒分离株与TaiWan95、广东株(GD-1-98)、江苏株(JS-5-1)在同一进化分支内,属基因Ⅶ型。     

两株鸽源新城疫病毒的分离鉴定及F基因序列分析

从四川省两个不同肉鸽养殖场的送检病鸽中分别分离出2株鸽源新城疫病毒(NDV),分别命名为Mianyang12505和sms12。致病性试验表明2株鸽源NDV均为弱毒,但融合蛋白(F)基因序列分析表明2个毒株均含有典型的强毒株F蛋白裂解位点112RRQKRF117;以F基因序列为基础构建遗传发育树,发现2株鸽源NDV属于基因Ⅵ型;F基因突变分析表明,鸽源NDVF基因突变率较大,且基因Ⅵ型和Ⅶ型存在规律突变;核酸和氨基酸序列同源性分析表明,国内鸽源NDV毒株核酸序列同源性为83.5%～99.7%,氨基酸同源性为85.6%～100%,且本研究分离的毒株与JS0722Pi同源性最高。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。     

一株新疆野鸟源新城疫病毒的分离鉴定、F基因克隆及遗传进化分析

为了解新疆野鸟新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）感染情况,分析其分子特征和基因变异特点,防止新城疫的暴发和蔓延,本试验用9日龄SPF鸡胚进行病毒的分离传代,HA、HI试验和RT-PCR方法对位于"东非-西亚迁徙线"福海县的野鸟进行了NDV检测,分离到1株野鸟源NDV,并命名为NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016。结果表明,该NDV分离株F基因ORF长1 662 bp,编码553个氨基酸,F基因碱性裂解位点序列为¹¹²G-R-Q-G-R-L¹¹⁷,符合弱毒株特征;遗传进化分析显示,NDV/Pintail/CH（XJ）/01/2016与乌克兰鸽源分离株Doneck/3/968、比利时鸭源分离株Simeonovgrad核苷酸同源性均为99.7%,属于NDV ClassⅡ基因Ⅱ型。而上述3株病毒均与疫苗毒La Sota具有较高同源性（99.5%~99.8%）。本研究结果为家禽NDV外流进入自然环境提供了论据。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城瘦病毒(NOV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因VIId亚型NDV 6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因VIb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验.在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品.以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量.结果表明,6株基因VIId亚型NDV毒株导致SPF鸡100%发病,死亡率90%以上,属于高致病性毒株;基因Ⅲ、VIb型毒株导致SPF鸡发病但不死亡,属于中等毒力毒株.VIId亚型毒株与F48E9株攻毒后SPF鸡在病理变化、组织嗜性及病毒载量上没有显著差异.根据毒株的MDT、ICPI指数及攻毒鸡病程综合判断,VIId亚型毒株在致病性上与F48E9株差异不显著.健康野鸟携带基因VIId亚型高致病性NDV,在NDV的自然生态传播过程中起重要作用,提示应该加强对野鸟的流行病学监测及相关研究.     

2013—2014年H7亚型禽流感病毒遗传进化分析

对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与遗传进化分析

2011年1月至3月,从江苏地区免疫蛋鸡群中分离出了3株H9亚型禽流感病毒(AIV),为了了解H9亚型禽流感在免疫鸡群中发生与流行的原因,研究采用RT-PCR技术对该病毒HA和NA基因进行扩增和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。研究结果显示:分离株与近期华东地区H9亚型AIV分离株关系最近;3株毒株之间的HA和NA基因均具有很近的亲缘关系,但在遗传发生树上与疫苗株具有较远的遗传距离,分离株与疫苗株之间的同源性在91%左右。     

一株Ⅶb型新城疫病毒的生物学特性研究

本研究对2013年新分离的一株鸡源新城疫病毒(NDV)(P1125)进行了致病指数测定、F基因测序和遗传进化分析,并对La Sota疫苗免疫的保护效力进行了评价。结果显示,该分离株致死鸡胚平均死亡时间为44 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.988,6周龄雏鸡静脉接种致病指数为2.71。F基因测序表明其编码区长度为1 662 bp,共编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒典型的分子特征,HN蛋白由571个氨基酸残基组成,属于C类NDV,表明该分离株为强毒株。遗传进化分析表明该分离株属于Ⅶb亚型。同源性分析显示该分离株与La Sota氨基酸相似率为88.4%。免疫保护试验表明,La Sota灭活疫苗能够对该分离株标准剂量攻击提供临床保护,但在攻毒1 d、3 d、5 d后均可以检测到排毒现象。本研究为研制专门针对我国流行株的新城疫新型疫苗及我国新城疫的防控具有重要意义。     

信鸽新城疫病毒的分离、鉴定及F基因的进化分析

2014~2016年,湖北、安徽、山东、河北、四川、陕西、天津等地的数家信鸽公棚疑似暴发鸽新城疫,导致大部分信鸽死亡或运动功能障碍,经济损失巨大。通过对病料利用鸡胚病毒分离法进行病毒分离,并结合血凝试验和血凝抑制试验,初步确定病料中均含有新城疫病毒。进一步通过RT-PCR方法对病毒的F基因进行扩增并测序和序列分析,发现分离毒株裂解位点均具有强毒的序列特点。F基因遗传进化分析显示,分离株基因型均为VIb型。研究结果与目前报道的导致信鸽新城疫的病原主要为VIb型一致。本研究将信鸽新城疫的有效防控提供了参考。