羊口疮病毒VIR蛋白生物活性鉴定及表位预测

为研究羊口疮病毒(ORFV)VIR蛋白的生物活性,扩增了绿色荧光蛋白基因EGFP和ORFV的VIR基因,构建了真核表达载体pVAX1-EGFP和pVAX1-VIR-EGFP,转染至BHK-21细胞,在荧光显微镜下进行了EGFP和VIR与EGFP融合蛋白的绿色荧光检测,用ORFV的全病毒血清作一抗,进行了Western ...     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株VIR基因的比较分析

羊传染性脓疱(Orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的一种人兽共患传染病。VIR是ORFV编码的抗干扰素基因。为比较分析ORFV疫苗弱毒株和野毒株编码的VIR基因的特征,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的VIR基因序列,比较分析了两者核酸水平和氨基酸水平的变异情况以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒VIR基因核苷酸序列相似性为94.6%,氨基酸序列相似性为91.8%,两者在Z-DNA结合结构域和ds-RNA结合结构域均有突变。     

蓝舌病毒NS4基因真核表达对IFN-β信号通路基因mRNA表达的影响

通过构建蓝舌病毒(BTV)NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,转染HEK-293T细胞,利用Western blot及荧光显微镜分析NS4蛋白的表达与亚细胞定位特征;pcDNA3.1-NS4-eGFP转染的HEK-293T细胞添加20 HAU/mL仙台病毒(SeV)刺激后,qRT-PCR法分析NS4基因表达对SeV诱导的上游识别基因RIG-Ⅰ、MDA5、VISA、TBK1、IKKε、IRF3、TRAF3、TRAF6、IRF9、干扰素基因(IFN-α、IFN-β)以及干扰素刺激基因ISG15和USP18的mRNA表达水平的影响。在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP质粒24 h后,分别添加20 HAU/mL SeV刺激24,48 h,qRT-PCR结果表明,细胞内表达NS4-EGFP后,RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15及IFN-β基因mRNA表达极显著下降,随着SeV诱导时间的延长,VISA、TBK1、IKKε、USP18基因mRNA表达差异呈不显著趋势。本研究成功构建BTV NS4基因真核表达载体pcDNA3.1-NS4-eGFP,NS4-EGFP融合蛋白在HEK-293T细胞中主要分布于细胞核周围及细胞核内。BTV NS4基因在HEK-293T细胞内的表达显著下调SeV诱导的IFN信号通路相关基因RIG-Ⅰ、MDA5、TRAF6、IRF9、ISG15和IFN-β的表达,为进一步探究NS4基因在BTV拮抗宿主细胞免疫应答中的机制奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒122蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

以提取的羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因组为模版,PCR扩增ORFV122基因,并将该基因连接至原核表达载体pET-28a上,构建出pET-28a-122重组表达质粒。然后将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经IPTG诱导后成功表达出ORFV122蛋白。利用His标签可与镍离子结合的特性对ORFV122蛋白进行分离纯化。将纯化后的ORFV122蛋白免疫BALB/c小鼠,制备相应的多克隆抗体,并利用Western blot技术检测该抗体的特异性。免疫小鼠获得的抗ORFV122蛋白多克隆抗体经ELISA检测,其效价约为1∶80 000。此外,使用该抗体对ORFV122蛋白的表达规律进行了研究,发现ORFV122蛋白为早期表达蛋白。本试验获得的ORFV122蛋白多克隆抗体为以后ORFV122基因功能的后续研究奠定基础。     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

抗羊口疮病毒蛋白ORFV086多克隆抗体的制备及其应用

本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

表达鹅γ干扰素重组禽痘病毒的构建及其抗病毒活性的初步研究

为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。     

重组鸡IFN-α-IL-18融合基因的酵母分泌表达及其抗IBDV活性研究

为探讨鸡IFN-α和IL-18及其融合蛋白抗IBDV活性,本研究将鸡IFN-α、IL-18及其融合基因分别置于酵母表达载体pPICZ-αA的AOX1启动子下游,构建重组质粒pPICZ-IFN-α、pPICZ-IL-18和pPICZ-IFN-α-IL-18。将重组质粒分别用PmeⅠ酶切线性化,电穿孔方法导入酵母Pichia Pastoris X-33感受态细胞,以1%甲醇诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达蛋白,淋巴细胞转化试验初步检测表达产物生物学活性,鸡胚接种试验对表达产物的抗IBDV效果进行评价。结果表明,在酵母培养上清液中存在相对分子质量分别为22 000、23 000和43 000的目的蛋白,表达的IL-18和IFN-α-IL-18对鸡淋巴细胞具有明显的诱导转化作用(P0.05)。IFN-α-IL-18融合蛋白能够显著抑制IBDV在鸡胚中的增殖(P0.01),IFN-α和IL-18酵母表达产物对IBDV也有明显的抑制作用(P0.05)。这为进一步开展IFN-α-IL-18融合蛋白的功能研究及其在鸡病毒性疫病防控中作用的探索奠定了基础。     

福建省羊传染性脓疱病毒F1L、B2L和VIR基因的遗传变异分析

为探明2014年-2015年在福建省流行的羊传染性脓疱病毒(ORFV)遗传变异情况,对10株ORFV流行毒株的F1L、B2L和VIR基因进行克隆、测序及分析。结果表明,10株ORFV F1L基因之间的核苷酸序列同源性为97.6%~100%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.3%~97.1%;同NZ2参考株比较,FJ-YT2014缺失2个氨基酸;10株ORFV B2L基因之间核苷酸序列同源性为97.5%~99.9%,与国内株的核苷酸序列同源性为96.7%~99.5%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为96.7%~97.7%;10株ORFV VIR基因之间的核苷酸序列同源性为95.8%~99.5%,与国内株的核苷酸序列同源性为94.6%~99.6%,与NZ2参考株的核苷酸序列同源性为94.6%~96.4%。基于基因核苷酸序列的遗传进化分析表明,10株ORFV F1L基因与福建省分离株、山西株和新疆株亲缘关系较近;10株ORFV B2L基因与新疆、山西、德国毒株亲缘关系较近;10株ORFV VIR基因与台湾、新疆株亲缘关系较近。结果提示,当前福建省流行的ORFV F1L、B2L和VIR基因尚未出现明显变异,但是其F1L、B2L和VIR基因核苷酸序列之间普遍存在异质性。     

干扰素刺激基因对羊口疮病毒在OFTu细胞中增殖的抑制效应

羊口疮病毒（ORFV）是重要的人兽共患病病原,不仅严重危害养羊业,而且威胁人类健康。干扰素刺激基因（stimulator of interferon genes,STING）作为细胞的DNA感受器,在机体天然免疫中起重要作用。为探索STING在ORFV感染中的作用及其对病毒复制的影响,本研究构建了ORFV感染羊胚胎鼻甲细胞（OFTu）的模型,分析了ORFV感染细胞后对STING及其相关基因的动态表达,探索了STING基因在干扰表达和过表达状态下对ORFV在细胞上增殖的影响。结果表明,ORFV感染OFTu细胞后,STING、cGAS、TBK1、IRF3、IRF7、IL-6、IFN-β、IL-1β和TNF-α的转录明显升高。OFTu细胞过表达STING可导致RIG-1、DDX41、IFI16、IRF3、IRF7、IL-6、TNF-α、IFN-α和IFN-β等基因转录上调。OFTu细胞在STING过表达状态下感染ORFV可介导TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的转录升高,抑制ORFV的复制;在STING表达干扰的状态下,ORFV感染OFTu细胞降低了TBK-1、IRF3、IFN-β和TNF-α的转录,增加了ORFV的复制。这表明STING蛋白能够增强抗病毒细胞因子的表达,抑制ORFV在OFTu细胞中的增殖,研究结果为深入理解STING在羊口疮病毒感染和复制中的作用提供了科学的理论依据,也为深入探索ORFV感染和致病的分子机制提供了基础数据。     

羊干扰素α和γ融合表达及抗病毒活性分析

为进一步探究羊干扰素α和γ的抗病毒活性效果，根据GenBank羊IFN-α和IFN-γ基因序列，使用Linker连接合成目的序列，成功构建了3种重组表达质粒pET28a-OviIFN-γ、pET28a-OviIFN-α、pET28a-OviIFN-γ/α并进行原核表达。用细胞病变抑制法和RT-qPCR测定重组蛋白rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ的抗病毒活性。结果表明，rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ在牛肾细胞(MDBK)以及非洲绿猴肾细胞(Vero)细胞中有抗病毒活性，且rOviIFN-α/γ的抗病毒效果最优；rOviIFN-α、rOviIFN-γ和rOviIFN-α/γ能够显著上调MDBK以及Vero细胞中4种干扰素刺激基因(IFN stimulated genes, ISGs)的mRNA转录水平，且rOviIFN-α/γ对干扰素刺激基因的上调水平最显著。综上所述，本试验表达的重组蛋白都具有抗病毒作用，其中串联表达的重组蛋白抗病毒活性以及干扰素刺激基因转录水平较高。     

表达鹅α干扰素基因重组禽痘病毒的构建及表达产物抑制鹅细小病毒活性的初步研究

为研究表达鹅α干扰素(GoIFN-α)基因重组活载体疫苗对抑制病毒增殖活性,本实验从植物血凝素刺激的延边白鹅外周血淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增gIFN-α基因,其大小为576 bp.将其与LacZ表达盒串联克隆于pSY681质粒中构建pSY681-IFN-α-LacZ转移重组质粒.采用脂质体将重组质粒转染于预感染禽痘病毒(FPV) 017株的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝/白斑筛选获得重组禽痘病毒rFPV-IFN-α.采用间接免疫荧光和western blot方法对重组毒鉴定结果显示,GoIFN-α基因在CEF中获得表达,分子质量约为29 ku.表达的CoIFN-α对鹅细小病毒在鹅胚成纤维细胞中的复制具有抑制作用.本研究为进一步开展GoIFN-α基因重组FPV活载体疫苗的体内试验奠定了基础.     

从江香猪源干扰素α2、β在生菜中的瞬时表达及其对PRRSV复制抑制作用的研究

为在生菜中瞬时表达从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β和IFN-β,检测其抗猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)的活性,本实验采用从江香猪源干扰素特异引物分别从p UCm-CJpoIFN-α2、p UCm-CJpoIFN-α2β、p UCm-CJpoIFN-β质粒中扩增IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β基因序列,分别克隆至植物表达载体p BI121中,构建含不同干扰素的重组质粒。将各质粒分别转化根癌农杆菌LBA4404,采用真空渗透法将携带重组质粒的根癌农杆菌感染生菜,经用GUS染色和ELISA方法检测从江香猪源干扰素在生菜叶片中的表达;用q PCR方法和细胞病变抑制试验检测生菜中表达的从江香猪源干扰素蛋白抗PRRSV的活性。结果显示:本实验构建了含从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β的植物表达载体PBI121-IFN-α2、PBI121-IFN-α2β、PBI121-IFN-β;GUS染色和ELISA检测结果显示从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中实现了瞬时表达;q PCR检测结果显示生菜中瞬时表达的从江香猪源干扰素蛋白在Marc145细胞中对PRRSV的复制有明显抑制作用;生菜中表达的从江香猪源IFN-α2、IFN-β、IFN-α2β分别经4~7、4~9、4~7稀释在Marc145细胞中仍然能够抑制100 TCID_(50)PRRSV的致细胞病变作用。本实验实现从江香猪源IFN-α2、IFN-α2β、IFN-β在生菜中的瞬时表达且表达蛋白具有较强抑制PRRSV的复制作用,本研究为从江香猪源干扰素抗PRRSV新复合型药物蛋白的开发利用提供参考依据。     

IFITM3对羊口疮病毒在羊胚胎鼻甲上皮细胞上增殖的影响

羊胚胎鼻甲上皮细胞(OFTu)是羊口疮病毒(ORFV)高效感染和增殖的细胞,为分析ORFV感染对OFTu细胞干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)表达的影响及探讨IFITM3的表达状态对ORFV在OFTu细胞上增殖的作用,本研究对ORFV感染OFTu细胞后IFITM3基因的动态表达进行了分析,并通过构建IFITM3不同表达状态的感染细胞模型,探讨了IFITM3的不同表达状态对ORFV在OFTu细胞上增殖的作用。结果表明,ORFV感染可以诱导细胞IFITM3的表达,感染后2 h开始逐渐升高,感染后6～36 h与对照组相比差异极显著(P0.01)。过表达IFITM3的OFTu细胞会在感染后的24和36 h显著抑制(P0.05)ORFV的增殖,干扰表达IFITM3的OFTu细胞在ORFV感染后的前36 h促进了病毒的增殖,但差异不显著。研究结果进一步丰富了IFITM3的抗病毒谱,也为深入探索该蛋白的功能及作用提供了基础数据。     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

吉林白鹅α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

用PCR方法扩增了吉林白鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pGEX-IFN-α,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞里,在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组吉林白鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子量大小约为43ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。重组吉林白鹅α干扰素经谷胱甘肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在鸭胚成纤维细胞上抗鹅细小病毒的活性为3.32×105 U/mg,本试验结果表明,该表达系统能够表达重组鹅α干扰素,且表达的重组鹅α干扰素具有一定的抗病毒活性。     

羊口疮病毒内蒙株的生物学特性

为增强羊口疮病毒(ORFV)的基础理论研究及羊口疮的防控等工作,本研究通过将毒株接种羊睾丸细胞进行增殖培养、病毒粒子的形态学观察、超薄切片观察、动物回归、B2L和VIR基因序列的测定与分析等试验,对待检毒株(内蒙古分离株ORFV/nm-W)进行了病毒学和分子生物学的特性研究。结果表明,本分离株能够引起羊睾丸细胞产生明显病变,病变开始出现和出现80%CPE的时间分别为接种后24和72h,病毒滴度TCID50为10-6.5。病毒粒子为椭圆形,在细胞质内增殖,接种毒株的羊只出现典型的CE症状。扩增后的产物经序列分析表明,ORFV/nm-W分离株的B2L基因和VIR基因与GenBank已发布毒株的该序列之间核苷酸同源性分别为96.7%~98.8%,96.2~99.3%,且该分离株与中国陕西株和新疆株同源关系最近。     

重组鸡α-干扰素的表达与抗病毒活性分析

为了表达具有抗病毒活性的重组鸡α-干扰素(IFN-α),试验根据大肠杆菌密码子的偏好性,对鸡IFN-α的成熟肽基因序列进行优化,合成后连接至原核表达载体pET30a-ELP,经体外诱导后表达重组蛋白ELP-ChIFN-α,借助重复可逆相变循环(ITC)法进行纯化;纯化蛋白经过变性、复性处理后进行安全性评价,采用微量细胞病变抑制法在犬肾细胞(MDCK)/水疱性口炎病毒(VSV)系统中进行蛋白抗病毒活性的检测。结果表明：合成的重组鸡IFN-α成熟肽基因能在原核表达系统中成功表达;不同浓度的重组蛋白ELP-ChIFN-α对细胞的生长抑制率为0;重组蛋白ELP-ChIFN-α在MDCK/VSV系统中具有抗病毒活性,活性为1.2×10⁶ IU/mg。说明原核表达的重组鸡IFN-α有较好的抗病毒活性,可作为鸡的抗病毒生物药物进一步开发研究。     

羊口疮病毒B2L基因密码子偏好性分析

B2L蛋白是羊口疮病毒(ORFV)的主要囊膜蛋白,为重要保护性抗原之一,可刺激机体产生强烈的抗体反应。本研究对B2L基因运用Visual Gene Developer生物信息学软件,分析其在大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫杆状病毒表达系统中的密码子使用偏好性,从而选择一个最适表达系统,以增加B2L蛋白的表达量。分析表明,B2L基因在昆虫杆状病毒表达系统中会得到更好的表达,这为B2L基因表达系统的选择提供了参考。     

羊传染性脓疱病的研究现状

羊传染性脓疱病是由羊传染性脓疱病毒(ORFV)引起的一种多种动物共患的传染病。ORFV是痘病毒科副痘病毒属的代表性成员之一,种属特性鲜明而独特。本文主要对该病的病原学、流行病学、临床特征、致病机理、病毒与宿主的相互作用等方面进行了概述,加深对ORFV生物学特性的理解,目的对ORFV建立有效的防制。