炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL~(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

贵州省一起皮肤炭疽疫情的病原学分析

为了对贵州省一起疑似皮肤炭疽疫情进行病原学检测和分析,以期为疫情的处置和防控提供科学依据,对患者皮肤渗出液、病死马肌肉及其刨剐地土壤样本进行炭疽芽孢杆菌分离培养,对疑似菌落采用革兰染色镜检、噬菌体裂解试验和青霉素抑制试验进行鉴定,进一步采用普通PCR和实时荧光定量PCR法(Real-time PCR)检测炭疽芽孢杆菌疑似菌株PagA、Cap及rpoB基因。结果共检出7株炭疽芽孢杆菌疑似菌株,其中从患者皮肤渗出液分离出1株菌,从土壤标本分离出6株菌。传统方法将7株疑似菌株鉴定为炭疽芽孢杆菌,普通PCR和Real-time PCR检测结果均显示7株菌株rpoB、PagA和Cap基因阳性。说明从患者皮肤渗出液和土壤标本均检出具有致病基因的炭疽芽孢杆菌,提示该起疫情为一起由炭疽芽孢杆菌所致的皮肤炭疽疫情。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。     

炭疽杆菌基因检测技术的研究进展

从炭疽杆菌基因组组成、炭疽杆菌基因组的特征及其在基因检测中的应用几方面阐述了炭疽杆菌基因检测技术的研究进展，探讨了分别位于pXO1和pXO2质粒上的主要致病毒素编码基因pagA、lef、cya和参与荚膜合成的主要蛋白编码基因capA、capB和capC的作用，认为这些炭疽杆菌特异基因序列是建立基因检测体系的可靠基础，其标志性序列有早期发现的序列指纹图谱、高度保守基因序列和最新发现的高度特异基因序列，基因检测方法从早期的RFLP、VNTR、单重PCR、多重PCR发展到最新的实时定量PCR，随着标志性序列特异性的增加和检测方法的改进，炭疽杆菌的诊断工作变得更加准确和快捷。     

炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的预测及耐药性与毒力分析

【目的】预测并分析炭疽芽孢杆菌携带前噬菌体的比例、前噬菌体携带抗生素耐药基因与毒力基因的情况,了解并分析炭疽芽孢杆菌前噬菌体对菌株耐药性与毒力的影响,为后续研究与应用炭疽芽孢杆菌前噬菌体提供借鉴。【方法】利用PHASTER在线分析软件预测炭疽芽孢杆菌携带的前噬菌体,采用抗生素耐药基因数据库(comprehensive antibiotic research database, CARD)和毒力因子数据库(virulence factors database, VFDB)预测前噬菌体携带的抗生素耐药基因和毒力因子。【结果】预测到1 421条炭疽芽孢杆菌前噬菌体,其中完整型前噬菌体267条,疑似型前噬菌体321条,不完整型前噬菌体833条。每株炭疽芽孢杆菌所携带的全部前噬菌体基因组占其基因组比例为3%～4%。771条前噬菌体携带1 075个耐药基因。耐药表型共有29种,分别来自28种不同的耐药家族,涵盖6种抗生素耐药的作用机制。394条前噬菌体编码688个毒力因子,归类为71种毒力基因和52种毒力因子。分析毒力因子可能的宿主菌株来源构成发现,除炭疽芽孢杆菌外,嗜肺军团菌亚种、蜡样芽孢杆菌、...     

炭疽杆菌RPA等温检测方法的建立和应用

为建立一种简单、快速的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)分子检测方法,本研究基于炭疽杆菌BA5345基因保守序列,设计合成1对重组酶聚合酶扩增(RPA)引物,通过对反应时间的优化,建立39℃恒温水浴锅检测炭疽杆菌的RPA方法。结果显示,所建立的RPA方法在39℃水浴锅中恒温反应30 min,能够特异性的检测炭疽杆菌;以重组质粒pUC57-BA5345作为模板,RPA方法对其检测下限为102拷贝/μL,与荧光定量PCR检测试剂盒检测下限一致,比常规PCR方法敏感性高100倍;RPA方法对污染皮毛临床样品的阳性检出率为65.71%,略低于荧光定量PCR试剂盒的检出率(71.43%),明显高于常规PCR的检出率(42.86%)。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速,结果确实可靠,适用于炭疽杆菌的快速检测。     

炭疽芽孢杆菌PCR鉴定方法的建立

根据炭疽芽孢杆菌3种特异性毒力基因的序列,包括保护性抗原基因(pag)、荚膜基因(cap)和S-层蛋白基因(sap),建立多重PCR鉴定方法。该方法检测11株炭疽芽孢杆菌均为阳性,检测29株非炭疽的其他需氧芽孢杆菌属菌株均为阴性。该方法检测模拟血液样品的灵敏度是2×10~6 CFU/mL(每1mL血液样品最低含有2×10~6细菌),而样品增菌后的检测灵敏度是2×10~2 CFU/mL。制备加入炭疽疫苗菌株芽孢的模拟土壤样品,经增菌培养后,PCR检测灵敏度为3×10~4芽孢/g。另外,还设计了炭疽芽孢外壁结构蛋白基因BclA的鉴定引物,利用该引物的PCR扩增片段长度以及测序结果,能够有效区分Ⅱ号炭疽疫苗菌株和临床分离菌株,本研究能够为炭疽临床诊断和环境监测工作提供技术支持。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR检测方法的建立

为建立新型高灵敏度的幼虫芽孢杆菌微滴式数字PCR (droplet digital PCR,ddPCR)检测方法,针对幼虫芽孢杆菌16S rRNA基因设计特异性引物和探针。通过对反应体系优化,建立幼虫芽孢杆菌ddPCR检测方法,并对方法的灵敏度、线性关系、特异性及重复性进行评估。结果:建立的方法与其他6株非幼虫芽孢杆菌无交叉反应,具有良好的特异性;线性关系良好(R^2=0. 991 4);灵敏度为2. 9 copies/μL; ddPCR检测的相对标准偏差(RSD)在0. 93%～5. 27%,重复性好。试验表明本研究建立的ddPCR方法可以对幼虫芽孢杆菌进行绝对定量检测。     

快速检测炭疽杆菌的实时荧光定量PCR方法的建立及评价

为建立一种能快速鉴定炭疽杆菌的检测技术,本研究根据炭疽杆菌染色体上的TJHP和BA5345 2个靶点,分别设计4对引物和2个探针,对10份已知浓度的炭疽杆菌DNA和阴性对照菌株DNA进行检测,将浓度最大的炭疽杆菌DNA进行10倍倍比稀释,用于检测4对引物及其探针的灵敏度,并选出2个针对TJHP和BA5345靶点的特异性强及灵敏度高的引物和探针进行重复性实验。结果显示,4对引物及其探针特异性较强,FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物的灵敏度为4.513×10^-5 ng/μL;该荧光定量PCR方法重复性好(t=1.178,P=0.332)。FP2/RP2和FP4/RP4 2对引物及其探针可用于炭疽杆菌感染初期的快速筛查以及临床辅助诊断。     

炭疽杆菌双毒力因子荧光PCR检测方法的建立及应用

由炭疽杆菌（Bacillus anthracis）引起的炭疽（anthrax）是严重危害人类和家畜健康的重大传染病。为了提高出入境口岸对不明粉未快件样品的查验效率,防范通过包裹夹带生化武器,本研究使用Taq Man探针技术,建立了针对炭疽杆菌两种毒力质粒pOX1和pOX2的双重荧光PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和稳定性进行了试验。结果显示：本研究建立的炭疽杆菌双重荧光PCR检测方法具有较强的特异性,只特异性检出炭疽杆菌pOX1和pOX2,而与金黄色葡萄球菌等19种对照病原菌均无交叉反应;灵敏度与单重荧光PCR方法相近,最低检测限可达10 copies/μL;稳定性好,反应体系低温保存2、4、6、8个月后,检测阳性质粒的Ct值和峰值相差不大。应用该方法检测600份猪牛羊组织样本,均未检出炭疽杆菌阳性核酸。本研究建立的双重荧光PCR检测方法为炭疽杆菌的快速检测提供了技术支撑。