新生Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养与鉴定

为探讨原代Wistar大鼠海马神经细胞的体外培养方法,本研究取新生24 h内的Wistar大鼠海马组织,无菌剪碎后采用胰酶消化法分离细胞,用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养,逐日在倒置相差显微镜下观察。结果发现,从海马组织中分离出的神经细胞具有增殖能力,细胞对数生长期为2~8 d,最长培养30 d;细胞经免疫荧光鉴定Nestin表达呈阳性;免疫组织化学结果显示,在传代培养细胞的胞体和突起均有NF阳性标记物,GFAP抗体和CD68抗体显色均为阴性。由此可见,分离培养的细胞是具有自我更新增殖和多分化潜能的神经元细胞。     

鸡原代输卵管上皮细胞体外分离培养与鉴定

为了探讨鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法,本研究分别对消化酶、消化时间、取材部位和表面包被物等条件进行比较和优化,筛选出鸡原代输卵管上皮细胞分离和纯化的最佳方法,并对培养细胞进行鉴定与传代。结果显示,取鸡输卵管漏斗部,0.25%胰酶+0.02%EDTA联合消化15min、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,在20%FBS包被的细胞培养瓶中可获得满意的输卵管上皮细胞分离效果,细胞贴壁性良好。培养的细胞在24h时成团贴壁,48~60h明显增殖,呈圆形或多角形"铺路石样"的单层细胞生长,72h后细胞增殖速度减慢,可以维持至10d以上,且传代后细胞贴壁生长良好,经姬姆萨染色和透射电镜观察鉴定为鸡输卵管上皮细胞。本研究建立的鸡原代输卵管上皮细胞分离培养方法可获得纯度较高的目的细胞,为研究鸭源鸡杆菌对鸡输卵管细胞的侵袭特性提供了良好的体外研究模型。     

猪脐静脉血管内皮细胞的分离及体外培养研究

为建立一种操作简单并且能获得大量猪血管内皮细胞的分离培养方法,本研究采集新生健康长白猪脐带,取其脐静脉血管,灌注0.1%的Ⅰ型胶原酶,于37℃水浴消化10 min后收集内皮细胞,培养于含20%胎牛血清的M199培养基中,长满单层后用胰酶消化传代培养。并对培养的细胞形态学、相关抗原和其他特征以及对病毒的易感性进行鉴定。结果表明,Ⅰ型胶原酶消化后可获得大量内皮细胞,细胞培养后的形态学观察显示细胞贴壁生长良好,呈典型的铺路石状排列;第Ⅷ因子相关抗原和细胞摄取乙酰化低密度脂蛋白均呈阳性,内皮细胞比率可高达100%。传3代后的生长曲线显示细胞传代后延迟期小于1 d,对数生长期约3 d,第5 d进入平台期,第7 d开始脱落死亡。病毒感染试验表明所获得的内皮细胞对猪瘟病毒高度易感,病毒生长与常用的PK-15没有区别。上述研究结果表明本研究建立的血管内皮细胞分离培养方法简便有效,为大量制备原代血管内皮细胞提供了可靠的方法。     

绵羊下丘脑神经元细胞培养与鉴定

通过改良神经元细胞体外培养体系,建立一种高效、可行的绵羊下丘脑神经元体外培养方法,为研究绵羊神经内分泌调节体系及季节性发情机理奠定基础。通过Ⅳ型胶原酶将90 d左右的胎羊下丘脑组织消化成单细胞悬液,接种到预先用多聚赖氨酸包被的培养皿中,2 d后更换为无血清培养基进行培养,并采用两种方法对神经元细胞进行鉴定。结果显示:培养2 d的下丘脑神经细胞,胞体较小且单个独立分布。培养4~6 d神经元的突起明显增多增长,神经元胞体变大。培养8 d的神经元细胞更加成熟,突起联系更加紧密,形成密集的神经细胞网络。培养12 d后,下丘脑神经元细胞活性减弱,部分细胞开始凋亡。通过RT-PCR检测发现,培养的下丘脑细胞能够表达神经元特异基因Noggin、TUBA4A,经免疫荧光鉴定下丘脑神经元细胞纯度为95.6%。这些结果表明,通过此细胞培养方法能够获得纯度较高的绵羊下丘脑神经元细胞,为进一步研究绵羊神经内分泌调节体系及季节性发情机理提供目标细胞。     

仔猪小肠上皮细胞的体外培养及猪流行性腹泻病毒对其感染性研究

本研究旨在建立一种操作简单的仔猪小肠上皮细胞体外培养体系，为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的相关研究提供材料。研究以未吃初乳的新生仔猪作为肠道供体，采用肠腔面刮取肠黏膜和机械分离分散的方式进行原代细胞的体外分离。采用0.1%胰蛋白酶差速消化法进行仔猪小肠上皮细胞的纯化；比较新生弱仔猪和正常仔猪作为供体对原代小肠上皮细胞活性的影响；MTT法比较不同代次原代细胞的增殖活性；免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR方法检测PEDV毒株CV777在原代小肠上皮细胞感染和增殖情况。结果显示，本研究建立的体外分离培养方法能获得增殖活性良好的原代小肠上皮细胞，具有明显的"S"型细胞增殖曲线。通过胰酶差速消化可得到纯度高、形态单一的小肠上皮细胞，同时细胞连续传代5次仍保持良好的增殖活性。弱仔猪和正常仔猪分离培养的小肠上皮细胞的增殖活性比较显示，两者并没有明显区别，这为降低原代细胞培养的成本提供新的思路。免疫荧光和实时荧光定量RT-PCR结果显示，PEDV可感染本方法分离培养的仔猪原代小肠上皮细胞，并在其中进行复制增殖。本研究建立了一种操作简单、实用性强、成本较低的仔猪原代小肠上皮细胞体外培养方法，该方法培养的原代细胞可作为PEDV分离培养和相关研究的基础材料。     

猪原代肝细胞的分离及体外培养模型的建立

采用剪切消化法 ,对猪肝细胞进行了分离和原代培养。结果显示 :分离的肝细胞即时存活率为 93.4 % ,培养存活率为 87.6 % ,并观测了肝细胞体外的生长形态和增殖规律 ,摸索了建立猪原代肝细胞体外培养模型的条件 ,为在细胞水平研究猪的营养代谢提供了方法和技术保障     

铅镉联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞形态学损伤的研究

为了观察铅、镉及其联合对新生大鼠大脑皮质神经细胞的形态学影响,本试验通过对原代培养的新生大鼠大脑皮质神经细胞经提取、纯化和鉴定后,分九组进行单独或联合染毒,染毒时间为12 h,显微镜观察神经细胞形态并测量其胞体短直径和突起长度的变化.结果显示,与对照组相比,各试验组神经细胞密度降低,神经网络减少;各试验组神经细胞胞体短直径显著减小(P<0.05),突起长度显著变短(P<0.05);随铅、镉单剂量作用浓度的增加,神经细胞胞体短直径和突起长度有减小趋势,但组问差异不显著(P>0.05).与相应铅、镉单独染毒组比较.各铅镉联合染毒组神经细胞胞体短直径减小、突起长度变短更加明显,部分组间差异显著(P<0.05).结果表明,铅、镉作用浓度与神经细胞形态改变存在明显的剂量一效应关系,铅镉联合表现协同毒性效应.     

蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系的建立

为了建立蒙古绵羊输卵管上皮细胞培养体系作为良好的体外研究模型,本试验取蒙古绵羊输卵管,运用0.25%胰蛋白酶消化的方法分离上皮细胞进行体外培养.对培养细胞进行形态学、免疫组织化学方法鉴定.原代培养细胞用胰蛋白酶/EDTA方法成功传代,传三代后检测其染色体核型.结果显示,成功获得了原代和传代培养细胞,经鉴定为上皮细胞,传三代后经染色体核型分析显示细胞核型正常,培养的细胞健康状况良好,可以用做体外研究模型.     

猪脑微血管内细胞的原代分离培养与鉴定

探讨获取纯度较高的原代猪脑微血管内皮细胞的分离和培养方法。采用1月龄的三元杂交猪,通过两次酶消化、BSA和Percoll非连续梯度离心获得较纯的脑微血管段后,接种于涂布有鼠尾胶的培养瓶进行原代培养;相差显微镜观察细胞并进行纯化和传代,采用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测法对培养的细胞进行鉴定。结果表明,培养24 h即可见细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,细胞呈短梭形,集落呈典型的"鹅卵石样",区域性单层生长,6~7 d内皮细胞开始融合,血管内皮细胞特异性标志物Ⅷ因子相关抗原表达阳性。说明本试验成功的培养出了纯度较高的脑微血管内皮细胞,为后续的体外血脑屏障模型的建立奠定了基础。     

猪颗粒细胞和胎儿成纤维细胞的分离培养与冷冻保存试验报告

本试验利用从成熟后的猪卵母细胞中获得的颗粒细胞与胎儿成纤维细胞作为下一步猪体细胞核移植的供核细胞作好准备,为转基因猪的研究奠定了基础。对从成熟卵母细胞中获得的颗粒细胞进行分离培养和冷冻保存;采用室温消化法分离培养猪胎儿成纤维细胞。结果表明,接种后的原代颗粒细胞和猪胎儿成纤维细胞经过5～6d后均可连生铺满皿底,细胞排列有序,可用于继代培养;猪胎儿成纤维细胞进行冷冻解冻后可以存活。利用成熟后的猪卵母细胞的颗粒细胞,可以简单而快速地分离与培养;通过室温消化法可以分离培养猪胎儿成纤维细胞,并且经过冷冻解冻后可以复苏存活,其存活率为80.2%。