水牛高低活力精子的差异蛋白质鉴定和分析

本研究开展了水牛的高低活力精子差异蛋白质组分析,利用Percoll法分离水牛高、低活力精子后分别提取总蛋白质,通过双向电泳技术获得了高活力精子和低活力精子的双向电泳图谱,图像分析表明,高、低活力精子中存在差异蛋白质18个,以高活力精子为对照组,其中6个蛋白质在低活力精子中表达量下调或缺失,12个蛋白质表达量上调。使用串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对差异蛋白质进行鉴定,成功鉴定了3种蛋白质:精子尾部结构蛋白2、α-ATP合成酶、α-琥珀酰辅酶A合成酶。这些蛋白质与精子结构形成和线粒体能量代谢有关。该研究发现了水牛高、低活力精子的蛋白质变化,为解释精子活力低下的分子机制提供的新的线索。     

水牛附睾尾精子的体外受精

采用肝素诱导获能 ,比较了 TAL P液和 BO液处理水牛附睾尾精子进行体外受精和细管冷冻精液体外受精的效果。结果表明 ,用 BO液和 TAL P液分别处理水牛附睾尾精子 ,受精后的卵裂率分别为 4 6 .6 7%和 5 3.73% ,发育率分别为 2 1.6 7%和 2 6 .87% ,其受精效果差异不显著。综合 2种方法 ,水牛附睾尾精子的受精率为 5 7.14 % ,受精后的卵裂率为 5 0 .39% ;发育率相对于培养卵为 2 4 .4 1% ,相对于卵裂卵为 4 8.4 4 % ;与细管冷冻精液 (5 6 .0 0 % ,5 4 .31% ,2 6 .72 % ,4 9.2 1% )相比 ,差异不显著。形态学观察还表明 ,用保温干储的方法可获得活率好、存活时间长的附睾尾精子。试验结果说明水牛附睾尾精子用于体外受精可以得到与细管冷冻精液相当的效果。     

精子功能相关精浆蛋白质的蛋白组学研究进展

精浆蛋白质对生殖过程中的精子功能有显著影响,包括顶体反应、精子获能、精子贮存、精子竞争和受精。精浆蛋白质的研究已有很长的历史,而且牛精浆蛋白、热休克蛋白、富含半胱氨酸分泌蛋白等几种主要的精浆蛋白质已被成功分离鉴定。蛋白质组学研究方法和技术的迅速发展,为全面解析精浆蛋白质组提供了新的研究策略,提高了研究者探索精浆蛋白质未知领域的效率。作者综述了精子功能相关精浆蛋白质研究的相关信息及近年来精浆蛋白质组的研究进展,从蛋白质水平上阐述了精浆蛋白质与精子获能、贮存及受精等功能的关系。     

水牛卵泡液差异蛋白质双向电泳方法的建立及质谱分析

旨在研究沼泽型水牛成熟前后卵泡内差异表达蛋白质的变化规律。采用双向凝胶电泳技术分离成熟卵泡液和未成熟卵泡液总蛋白质,建立和优化了卵泡液的双向电泳体系,并使用质谱鉴定差异表达蛋白点。结果显示,丙酮沉淀法处理得到的总蛋白质样品后,在24cm(pH 4～7)胶条且上样量350μg时得到分辨率较好的双向电泳图谱。软件分析得到11个差异蛋白点,以成熟卵泡液作为对照,5个蛋白点表达上调,3个蛋白点表达下调,1个蛋白点缺失,2个蛋白点在未成熟卵泡液中特异性表达。质谱成功鉴定出4个蛋白质:过氧化物酶-2、醛糖还原酶、牛纤维蛋白原的晶体结构、转甲状腺素蛋白。该研究建立了良好的卵泡液双向电泳体系,分析并鉴定一批水牛卵泡液差异蛋白质,对于研究水牛卵母细胞的发育微环境和成熟机制提供了新的研究线索。     

水牛分离精子与不同来源卵母细胞体外受精的效果研究

本研究的目的是探讨水牛分离精子与不同来源(活体采卵或屠宰场卵巢采卵)卵母细胞体外受精的效果。活体采卵是选用20头空怀河流型母水牛(其中摩拉母牛12头,尼里-拉菲母水牛8头)每间隔3 d采卵1次,连续采卵5~6周,活体采集卵母细胞;屠宰场卵巢采卵是收集屠宰场水牛卵巢,用10 mL注射器连接18 G针头吸取水牛卵巢上可视的卵泡来收集卵母细胞。将收集的AB级水牛卵母细胞在相同的条件下进行体外成熟、然后用分离或未分离精子进行体外受精以及体外培养至囊胚。结果发现:活体采卵组和屠宰场收集的水牛卵母细胞组用分离精子受精分裂率和囊胚率没有差异(P>0.05);分离精子和未分离精子的体外受精分裂率和囊胚率也没有差异(P>0.05)。由此说明,水牛分离精子可以用于体外生产性控胚胎。     

利用分光光度计检测水牛精子密度

应用法国IMV卡苏公司生产的精液精子浓度分光光度计检测水牛精液精子密度,并与国产精液浓度分光光度计、血球计数板两种仪器的检测结果作比较。三种检测结果差异不显著（P＞0．05）。     

绵羊精浆蛋白质组2-DE图谱的构建及初步分析

本研究比较了丙酮沉淀法制备蛋白质不同上样量对绵羊精浆蛋白质二维电泳图谱的影响。结果显示,精浆总蛋白经SDS-PAGE电泳,得到分子质量在14.4~116 ku的28条蛋白质条带。二维电泳图经PDQuest 8.0分析,上样量为0.8、1.0、1.2 mg时检测出的蛋白质点分别为207±10、281±13和374±16个,分子质量基本分布在20~80 ku、等电点为4~9的区域内,随着上样量的增加,分子质量在20~80 ku的蛋白质点明显增多,但每个分子质量区间的蛋白质点所占的比率较为恒定。研究结果表明,采丙酮沉淀制备精浆蛋白结合合适的上样量能够建立绵羊精浆全蛋白质图谱,为进一步研究绵羊精浆蛋白质组学奠定基础。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

水牛SND1基因克隆及生物信息学分析

试验旨在利用电子克隆法对水牛SND1（staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1）基因进行克隆和序列分析,为探究该基因对水牛泌乳性能的作用机制奠定基础。以奶牛SND1基因（GenBank登录号：NM_205784.1）作为种子序列,利用Primer Premier 5.0设计3对引物,以水牛基因组DNA为模板,PCR扩增水牛SND1基因mRNA序列,扩增获得序列连接pMD18-T载体,通过测序拼接获得水牛SND1基因mRNA全序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,水牛SND1基因完整编码序列长为3 503 bp,包含长为2 733 bp CDS序列,编码910个氨基酸,蛋白分子式为C₄₅₂₃H₇₁₈₃N₁₂₈₁O₁₃₅₄S₂₆,分子质量为102.01 ku,理论等电点（pI）为6.74,不稳定系数为42.07,平均亲水性为-0.419,属可溶酸性蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占37.80%,无规则卷曲占34.18%。结合Protfun 2.2在线软件对SND1的功能进行预测分析表明,该蛋白在嘌呤和嘧啶、中央中间代谢、能量代谢、氨基酸生物合成发挥功能的可能性分别为0.449、0.401、0.303和0.262。SND1基因编码区序列与黄牛、绵羊、山羊、猪、马、人的同源性分别为98.7%、97.8%、97.8%、93.8%、93.1%和91.7%,物种之间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。利用SMART在线软件预测蛋白结构域,结果显示,水牛SND1蛋白包含有4个SN区域,说明SND1基因编码区在进化过程中较为保守。     

奶水牛HSD17B4基因的克隆及序列分析

17β-雌二醇脱氢酶Ⅳ(17β-Hydroxysteroid dehydrogenaseⅣ,HSD17B4)是一种在类固醇代谢过程中发挥重要作用的酶蛋白。为了阐明HSD17B4基因对水牛繁殖性能的影响,试验以奶牛HSD17B4基因序列(登录号:NM_001007809.2)为探针设计引物,利用PT-PCR克隆水牛HSD17B4基因,并对基因的核苷酸序列和蛋白质序列特征进行生物信息学分析。结果显示,水牛HSD17B4基因mRNA序列全长2 680 bp,其中5'端长145 bp,3'端长324 bp,CDS序列长2 211 bp,编码736个氨基酸。同源序列分析显示,水牛HSD17B4基因编码序列与其他物种具有较高的同源性,证明成功克隆水牛HSD17B4,为进一步阐明该基因在水牛上的作用机制奠定基础。     

摩拉水牛基因组DNA的RAPD分析

摩拉水牛俗称印度水牛,原产于印度的雅么纳河西部,它是世界上著名的乳用水牛品种,年平均产奶量220 0～300 0 kg,乳脂率7.6%.该牛具有耐粗饲、耐热、抗病能力强、繁殖率高、遗传稳定的优点,但集群性强,性较敏感,下奶稍难,宜在水源多的地方饲养.     

Osteopontin gene polymorphism association with milk traits and its expression analysis in milk of riverine buffalo

Osteopontin gene is regarded as a plausible candidate in mammary gland differentiation and development, expressed by variety of cells, tissues, and biological fluids including milk. The current study was performed in two phases. In the first phase, Osteopontin gene polymorphisms were identified and associated with milk composition such as ash, milk fat, SNF, lactose, and protein. In the second phase, milk samples from five healthy mastitis-free Nili Ravi buffaloes were analyzed for expression of Osteopontin gene at transition (day 15), mid (day 90), and end (day 250) stage of their second lactation. Briefly, blood samples were collected from Nili Ravi buffalo to isolate the genomic DNA, specific primers were designed for PCR amplification. The amplified PCR products were sequenced bi-directionally. Six polymorphisms were identified in the coding region and four in the intronic region of the gene. The results showed that SNP g.38329758 T > C causing substitution of valine to alanine (V127A) was associated with high milk protein. For mRNA expression analysis, somatic cells were separated from milk samples for RNA isolation. Analysis of differential gene expression data has permitted us to illustrate the expression pattern of osteopontin gene in lactating buffalo. The Osteopontin gene was found to be transcribed among all three lactation stages, but expression was observed with the highest value (fold change) in peak lactation and remained elevated till the end of lactation. Identified gene marker may be helpful for the prediction of superior animal for selection. The presented study also gave an insight into the genetic screening and lactation biology of riverine buffalo, offering direction for future research in lactating buffalo.     

奶牛CRP基因多态性与奶牛乳腺炎及乳质乳量的相关性研究及生物信息学分析

选用400头中国荷斯坦奶牛取血样400份,每份各2管。根据奶牛CRP基因序列设计2对引物,利用PCR-SSCP技术检测CRP基因的多态性,并用透射免疫比浊法测定奶牛血清CRP水平,然后运用SPSS等统计学软件对其与乳房炎及乳质、乳量的关系进行统计分析。结果显示,在第1对引物的扩增片段中检测到多态位点,出现3种基因型(AA、AB、BB),第2对引物的扩增片段中并未检测到多态位点。将第1对引物所扩片段的不同基因型与奶牛乳腺炎的相关性作关联分析,结果3种不同基因型奶牛的体细胞数、乳质率、蛋白率、305d产奶量均无显著差异,但患乳房炎奶牛个体全为AA型。而CRP含量检测结果可知患乳房炎的奶牛与正常个体之间的血清CRP含量并无显著差异。     

猪细胞巨化病毒四川株MCP基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

参照GenBank公布的仅有的日本株猪细胞巨化病毒较大衣壳蛋白（MCP）基因序列（登录号：AB051069）设计2对引物,采用分步克隆的方法,将PCMVMCP全序列克隆入pMD19-T载体进行测序,成功获得了pMD-MCP重组质粒,将所得序列录入到GenBank中（登录号：HQ025802）。测序结果表明,该MCP基因全长4017bp,共编码1338个氨基酸;与NCBI上公布的仅有的日本毒株MCP基因的核苷酸同源性为96．8％,氨基酸同源性为94．1％;进化分析显示：PCMVMCP基因与人疱疹病毒6型或7型的MCP基因亲缘关系较近;利用生物信息学软件对蛋白质结构特征进行分析,发现该蛋白含有59个潜在的磷酸化位点,潜在功能强大;亚细胞定位预测结果表明该蛋白主要存在于线粒体中和细胞质中并各占39．1％和26．1％,内质网占17．4％,高尔基体占8．7％,空泡和细胞核均占4．3％,表明PCMVMCP蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞质移动的趋势;另该成熟蛋白存在18个主要的抗原位点,将肽链经亲水性与抗原表位的共同分析,发现其肽链的c端极有可能分布有抗原决定簇。     

PCR-SSCP analysis of leptin gene and its association with milk production traits in river buffalo (Bubalus bubalis)

Leptin gene has been found to be associated with various economic traits including milk production and fat quality in dairy animals. In the present study, we investigated genetic variations in intron 1 region of leptin gene in riverine buffaloes (Bubalus bubalis) using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) and sequencing methods and associated them with milk traits. The study revealed three SSCP variants A, B and C among a total of 301 buffaloes from nine breeds. The frequency of variant C was found invariably high among all the breeds except in Marathwada buffalo. Variant A was found to be absent in Chilika, Nili-Ravi, Nagpuri and Pandharpuri breeds and also had the lowest frequencies in Mehsana, Jaffarabadi, Murrah and Toda breeds. Sequencing of SSCP variants revealed a total of five polymorphic sites, with three haplotypes. Statistical analysis revealed significantly high fat percentage at 150?days in SSCP variant B in Mehsana buffaloes. However, the associations of SSCP variants of leptin gene with total milk yield, 305?days milk yield and total fat yield were found to be non-significant. The present study is the first report on association analysis of leptin gene polymorphisms with milk production and milk quality traits in river buffalo.     

德昌水牛母牛体重体尺的相关性与回归分析

对德昌水牛95头生长发育母牛的体重与体尺指标进行相关分析,得出其体重与胸围、体长的相关系数达到0.9209和0.5788;经逐步回归分析法建立了最优回归方程：体重（y）=-737.381＋432.772×胸围＋262.598×体斜长,为早期考察德昌水牛生长发育情况提供了依据。     

猪SOCS1基因的克隆、生物信息分析及热应激条件下的表达

本试验克隆了土杂猪SOCS1基因cDNA序列,发现SOCS1基因cDNA编码220个氨基酸的前体蛋白。该蛋白相对分子质量24 370,等电点(PI)10.98,与GenBank中登录的普通猪、人、牛、羊和小鼠SOCS1序列同源性分别为99.9%、97.1%、96.1%、94.3%和93.7%。具有1个中央SH2域(Scr-homology 2)、1个长度可变的N端结构域和1个位于C端包含40个氨基酸残基的保守序列(SOCS盒)。荧光定量PCR结果显示,脾脏、小肠和胸腺中SOCS1mRNA的表达在热应激条件下显著上调(P≤0.05),且呈时间依赖性。但在肠系膜淋巴结中,热应激第3、6、9天显著下调(P≤0.05)。结果表明,SOCS1表达量在热应激条件下的土杂猪发生明显改变,并呈组织和时间依赖性。