Marc-145细胞微载体悬浮培养消化放大技术研究

为了建立Marc-145细胞微载体培养放大技术,使其用于猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)疫苗的规模化生产,试验在7 L生物反应器内微载体培养Marc-145种子细胞,再用胰蛋白酶消化,然后进行逐级放大培养,并通过细胞最佳消化状态试验、保留胰蛋白酶消化液的影响试验、测试回收微载体试验等方法摸索胰蛋白酶消化放大技术参数。结果表明:Marc-145细胞在初级生物反应器内培养时,微载体使用量为5 g/L,细胞密度达3.18×10~6个/mL,并且在状态饱满时进行消化放大;在14 L生物反应器内培养时,Marc-145细胞均匀分布在微载体上并且代谢旺盛,在细胞密度为2.91×10~6个/mL时进行14 L消化放大;在14 L生物反应器内培养Marc-145细胞时,采用批培养方式,细胞比生长速率最大达0.031/h,在培养96小时时细胞密度达2.37×10~6个/mL。说明试验成功建立了生物反应器微载体培养Marc-145细胞的胰蛋白酶消化放大技术,并实现了逐级放大。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

应用生物反应器生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原

应用激流式生物反应器培养Marc-145细胞生产高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒,并通过工艺优化,实现了病毒抗原的高效生产。首先将Marc-145细胞用含6 0mL/L牛血清的DMEM培养液复苏放大培养,当细胞量达到3×109时,接种入反应器中。先用细胞生长液培养,当细胞达到最大量时更换生长液为维持液,并接种HP-PRRSV。整个过程采用流加方式,每8h采样测定培养上清中葡萄糖浓度。接种病毒后,每24h测定培养上清HP-PRRSV滴度。6个批次细胞生长至88h,糖耗达到最高水平。连续3个批次种毒后培养至96h,上清中HP-PRRSV滴度达到最高,平均约为每106.4 TCID50/0.1mL。因此,认为应用激流式生物反应器进行细胞培养,通过过程工艺优化,可以实现HP-PRRSV抗原的高滴度生产。     

微载体灌注培养Marc-145细胞制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗

对在生物反应器中用微载体连续灌注培养Marc-145细胞生产猪繁殖与呼吸综合征病毒的制备技术进行了研究.在14 L体积的生物反应器中,加入含10 g/L微载体的细胞培养基DMEM,接种Marc-145细胞至细胞浓度为1×105/mL,培养4d后细胞可生长至5～7×106/mL,然后以感染复数(MOI)为0.01接种PRRSV PC株病毒,接毒后36 h开始收获,连续收获3d左右,收获的病毒滴度范围在106.0～ 1073TCID50/mL之间,将收获的病毒液加入适量的保护剂,经冷冻干燥制备成疫苗,无菌、支原体等项目的检验均合格,3批疫苗的免疫保护率均为5/5.实验表明,用生物反应器微载体灌注培养Marc-145细胞制备PRRS疫苗工艺可行.     

微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒的工艺研究

从细胞接种密度、病毒接毒量、培养基三个方面进行研究和优化,并进行放大培养,建立了猪瘟病毒的微载体悬浮培养工艺:细胞接种密度为每个微载体15个细胞,病毒接毒量0.05 MOI,采用DMEM/F12培养基进行培养和细胞消化瓶批式消化分散细胞,培养的细胞可以完成生物反应器10 L到50 L的放大,培养的病毒含量达到7.6 l...     

不同微载体浓度在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒培养中的比较

正微载体悬浮培养高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒是提升该疫苗产品质量的重要工艺技术,细胞微载体悬浮培养不仅可以提高单位体积内的细胞量、提高病毒产品效价,同时还具有劳动成本低、产品批间差异小等优点。在提升并保证病毒含量的基础上降低微载体的使用浓度,是生产部门提质降本的方向。我公司利用5L和50L生物反应器微载体悬浮培养Marc145细胞,对接毒时细胞活力、细胞密度的选择、接毒剂量、病毒收获时机等工艺参数优化基础上,进行了微载体使用浓度的比较,确定了适合的微载体使用浓度,达     

不同MDCK单克隆细胞株对H5亚型禽流感病毒增殖条件和放大工艺的研究

为了解H5亚型禽流感病毒rFJ56株在MDCK全悬浮细胞上的增殖规律,确定100 L生物反应器工艺的最适接毒量和收获时间,对H5亚型禽流感病毒rFJ56株敏感的MDCK全悬浮细胞进行单克隆筛选和全悬浮驯化,筛选出对该毒株最敏感的MDCK单克隆细胞株;在摇瓶工艺的基础上,将该细胞在100 L生物反应器中接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,检测接种后不同时间病毒HA效价和病毒滴度(EID_(50)),确定最适接毒量和收获时间。共筛选出22株MDCK全悬浮细胞单克隆细胞株,其中5株对H5亚型禽流感病毒rFJ56株最敏感,接种后病毒HA效价均可达到9 log2;对MDCK单克隆细胞株按0.01%体积比接种H5亚型禽流感病毒rFJ56株,在100 L生物反应器中培养60 h,HA效价可达10 log2,病毒含量可达10~(8.17)EID_(50)/0.1 mL,可为H5亚型禽流感病毒无血清全悬浮培养放大工艺提供参考。     

BHK-21细胞悬浮驯化及对新城疫病毒悬浮培养工艺研究

为建立新城疫病毒在BHK-21细胞的无血清全悬浮培养工艺以获得高滴度和高纯度的新城疫悬浮培养抗原,通过悬浮培养驯化和筛选获得了形态良好、稳定传代的BHK-21-sc悬浮细胞株;该细胞以初始密度0.5×10~6 cells/mL接种,培养72 h可增殖到6×10~6cells/mL,细胞活率达95%。以5 L生物反应器悬浮培养BHK-21-sc细胞,对鸡新城疫病毒La Sota株的接毒剂量、TPCK胰酶添加浓度、病毒培养温度、收获时间等工艺参数进行了摸索和优化;并在5L-16L-50L生物反应器中进行逐级放大,以优化后的鸡新城疫悬浮培养工艺进行3个批次病毒悬浮培养。最终确定鸡新城疫病毒La Sota株接种BHK-21-sc悬浮细胞株的悬浮培养工艺:BHK-21-sc细胞悬浮培养的第3天按照感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.005接种病毒,并添加终浓度为5μg/mL的TPCK胰酶,于33℃培养72 h后收获病毒液。应用该悬浮培养工艺在5、16、50 L反应器上悬浮培养BHK-21-sc悬浮细胞株生产鸡新城疫病毒HA滴度不低于9log2,病毒含量不低于10~(6.0)TCID_(50)/0.1mL。表明BHK-21-sc细胞无血清全悬浮生产鸡新城疫病毒工艺稳定,可以实现逐级放大和规模化生产。     

生物反应器中PRRSV TJM株在Marc-145细胞上最佳增殖条件研究

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)TJM株,对细胞培养条件、细胞接种量、微载体的用量以及病毒培养时间等条件进行了优化。结果表明,利用生物反应器悬浮培养Marc-145细胞在血清为金源康且含量为10%、培养基为DMEM、细胞接种密度为20~30细胞/球、微载体为5 g等条件下生长状态最好;病毒最佳培养时间为27~36 h,病毒增殖效果好且能够达到最高的病毒滴度。本试验为微载体培养条件下大规模生产PRRSV-TJM株疫苗奠定了一定理论基础。     

Marc-145细胞的无血清悬浮培养基开发

为开发适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,试验将贴壁Marc-145细胞转入Celer-S001培养基中进行悬浮适应,通过混料试验和水解物筛选试验获得适应Marc-145细胞快速扩增的无血清悬浮培养基,对悬浮培养的Marc-145细胞进行猪繁殖与呼吸综合征病毒感染并检测病毒效含量,评价悬浮培养的Marc-145细胞的病毒扩增能力。结果表明：Marc-145细胞可以在Celer-S001培养基中悬浮培养,其比生长速率为(0.25±0.06)/d;适应Marc-145细胞快速扩增的最优无血清悬浮培养基由B3和B8培养基以0.54∶0.46比例混合,并添加2 g/L的水解物H3构成,Marc-145细胞的比生长速率为(0.51±0.03)/d,密度为3.73×10⁶ cells/mL;细胞接毒后的病毒含量最高可达(5.25±0.25)lgTCID₅₀/mL,表明细胞仍然保持着病毒扩增能力。说明试验成功开发了适合Marc-145细胞生长的无血清悬浮培养基,Marc-145细胞在该培养基中生长良好,具有病毒扩增能力。