猪伪狂犬病病毒gE抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)-猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物,以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带,制作检测猪伪狂犬病毒gE抗体的双抗原胶体金试纸条。利用方阵滴定试验筛选出金标抗原最佳工作浓度为17.6μg,检测线诊断抗原最佳标记量为1.76μg,血清最佳稀释度为1∶10,作用时间15 min,与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪布鲁菌(Brucella)阳性血清和PRVgE缺失疫苗接种的猪免疫血清检测线均不出现红色条带,与PRV标准阳性血清反应检测线出现红色条带。试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果;试纸条在室温保存6个月,其特异性和敏感性没有明显变化;与美国IDEXX和法国LSI gE-ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较,1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。     

猪伪狂犬病gB抗体快速检测试纸条的研制和评价

为了建立一种猪伪狂犬病gB抗体检测试纸,为养猪业基层工作人员提供一种快速简便的狂犬病免疫抗体评价方法。胶体金标记gB蛋白作为探针,SPA和猪抗伪狂犬病病毒多抗IgG分别作为检测线和质控线,建立了猪伪狂犬病gB抗体检测试纸。猪伪狂犬病质控血清和疫苗免疫猪血清用来评价其特异性,敏感性以及与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率试验。试验结果显示,该试纸条具有较高的特异性和敏感性,与IDEXX PRV gB ELISA试剂盒的符合率为91.04%;该免疫层析试纸条具有快速(5min)、特异、敏感等优点,不需要专门的仪器设备和专业技术人员,适合于田间推广应用。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

猪圆环病毒2型抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

为建立便捷、快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的免疫层析方法,本研究利用G蛋白标记胶体金制备金标垫,以PCV2病毒样颗粒(VLPs)和兔Ig G分别作为检测线与质控线组装胶体金试纸条。检测结果显示,该试纸条与A型塞内卡病毒(SVA)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)等猪其它病毒抗体阳性血清无交叉反应,仅对PCV2抗体阳性血清具有高度的特异性;对PCV 2阳性血清最低检测限为1∶6 400稀释度,敏感性较高;批内、批间变异系数CV均小于5%,重复性较好。试纸条在4℃保存6个月,其特异性和敏感性无明显变化。对采集的100份临床血清样品进行检测,该方法与标准ELISA的总符合率为98%。表明本研究建立的PCV2抗体的胶体金免疫层析检测方法具有敏感、特异、稳定等特点,可以做为评价PCV2疫苗免疫效果及其感染筛查的检测方法。     

2012～2017年我国部分地区规模化猪场PRV野毒流行病学调查

为了监测我国规模化猪场伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)野毒感染情况,本研究采用伪狂犬g E抗体ELISA检测试剂盒对2012年2月~2017年7月送检的我国11个省份925个规模化猪场的44809份猪血清样品进行PRV野毒抗体检测。结果显示,925个猪场中有508个野毒阳性猪场,占检测猪场总数的54.91%,检出9153份阳性猪血清,平均阳性率为20.42%。其中种猪的野毒感染情况最明显,检出率较高,阳性率为23.19%;育肥猪的阳性检出率最低为17.22%。调查表明,我国规模化猪场猪群中仍存在PRV野毒感染。同时,本调查分析了不同地区、不同日龄猪的PRV野毒感染情况及该病的流行趋势,为我国伪狂犬病的净化提供思路。     

北疆地区猪伪狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗体检测与分析

为了解2014年2月至2016年4月新疆北疆地区猪伪狂犬病病毒野毒感染情况,试验从北疆地区的17个规模化猪场(克拉玛依、沙湾、石河子、玛纳斯4个不同区域)采集血样932份,采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测猪伪狂犬病病毒g E蛋白抗体水平,结果发现有139份阳性血清,平均阳性率为14.91%。对4个不同区域PRV g E蛋白抗体分析发现,玛纳斯区域的平均阳性率最高,为18.27%。试验对猪场的PRV g E蛋白抗体检测呈阳性的个体进行分析发现,玛纳斯区域的阳性个体平均S/N值最大,为0.269 1。研究表明,虽然北疆地区PRV g E蛋白抗体阳性率较低,但各猪场普遍存在PRV,希望该试验对北疆乃至全疆各猪场PR的预防和净化工作有所帮助。     

某规模种猪场猪伪狂犬病的净化与防控

为了检查出北京市郊区某规模种猪场隐性伪狂犬病感染猪并加以淘汰,达到净化猪场的目的,应用伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白抗体ELISA检测试剂盒对不同阶段猪群血清进行抽检。结果表明:该种猪场不同阶段猪均存在PRV gE抗体阳性猪,采取普检种猪并淘汰PRV gE抗体阳性猪、调整免疫程序、抓好综合性防控措施、采用PRV gB蛋白抗体ELISA检测试剂盒检测免疫抗体等方法,使该种猪场猪的伪狂犬病得到了净化。说明用PRV gE蛋白抗体ELISA检测试剂盒对血清样本进行检测,发现并淘汰PRV gE抗体阳性猪、调整免疫程序可以净化猪伪狂犬病。     

青海省互助县猪伪狂犬病病毒感染情况调查与分析

<正>猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一种以妊娠母猪繁殖障碍和哺乳仔猪神经症状及高死亡率为主要特征的急性传染病,是危害养猪业健康发展的重要疫病之一,目前国内外普遍采用PRV g E基因缺失疫苗对PR进行免疫预防,通过检测g E抗体鉴别区分疫苗免疫抗体和野毒感染抗体,从而能有效监测猪群中PRV野毒感染情况,逐步淘汰PRV野毒感染猪。     

常州金坛区猪伪狂犬病的流行病学调查

为了解金坛区规模化猪场伪狂犬病(PR)免疫和感染现状,为该病的净化提供依据,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对该区内8个乡镇47个规模化猪场的634份猪血清样品进行伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染抗体和疫苗免疫抗体的检测。结果显示,全区有3个乡镇存在PRV野毒感染,47个规模场中4个为阳性场,共8份样品为野毒g E抗体阳性,总体阳性率为1.26%。全区免疫场比例不到一半,各镇免疫抗体阳性率参差不齐,为44.44%~95.56%。说明该地区存在PRV野毒感染,但并不严重;各镇PR免疫水平差别较大,提示应进一步提高免疫质量,降低PR发生和流行隐患。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的实验室诊断

为了确诊贵州省某规模化猪场保育仔猪异常死亡原因,从怀孕母猪、产房母猪、后备母猪、种公猪、哺乳仔猪、保育仔猪6个猪群采集90份血清样本采用ELISA方法分别进行血清抗体检测,并对采集的90份血清样本和1份病死猪淋巴结组织采用荧光PCR方法进行病原学检测。结果:6个猪群综合的猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒g B蛋白、伪狂犬病病毒g E蛋白血清抗体阳性率分别为87.78%、70.00%、88.89%、4.44%;猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒病原核酸检测显示阴性,猪圆环病毒2型病原核酸检测淋巴结组织样本显示阳性。试验结果表明,引起该猪场保育仔猪死亡的原因为猪圆环病毒2型感染。同时,怀孕母猪群出现了伪狂犬病病毒g E蛋白抗体阳性,提示怀孕母猪群可能存在猪伪狂犬病野毒感染。     

猪伪狂犬病毒野毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪伪狂犬病毒(PRV)野毒抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了猪伪狂犬病毒gE蛋白,以纯化的重组gE蛋白为包被抗原建立了检测猪伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRV基因组gE基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约606 bp的gE基因片段,将目的片段亚克隆至pET30a原核表达载体中,经IPTG诱导重组gE蛋白的表达,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测伪狂犬病毒野毒抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、PRV疫苗毒的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与IDEXX gE-ELISA抗体检测试剂盒的符合率为96.2%。本研究建立的gE-ELISA检测方法为PRV野毒抗体检测以及野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便、快速、高通量的血清学检测方法。     

猪伪狂犬病病毒HNX株在免疫猪群中水平传播能力的研究

为研究猪伪狂犬病病毒(PRV)HNX株水平传播的能力及PRV活疫苗的保护效力,本研究通过以颈部肌肉接种PRV HNX株(2 m L 107 TCID50)的未免疫猪作为病毒的传染源,同居感染未免疫猪和Bartha-K61株活疫苗免疫猪,通过检测抗PRV的g B和g E蛋白抗体、中和抗体及干扰素水平等评估疫苗保护力,并利用荧光定量PCR方法检测同居感染猪排毒情况。结果显示Bartha-K61株活疫苗能够快速诱导免疫猪产生抗g B蛋白的抗体,但疫苗诱导产生的交叉保护中和抗体水平较低。同居感染期间,免疫猪和未免疫猪均出现典型的临床症状,体温明显升高。荧光定量PCR方法结果显示,疫苗免疫能够减少免疫猪排毒,但不能阻止排毒,也不能阻止野毒感染。本研究结果表明Bartha-K61株活疫苗阻止PRV HNX株水平传播的效力是有限的,有必要更换疫苗病毒株。同居感染期间,每组感染猪均表现敏感,表明PRV HNX株病毒具有较强的水平传播能力。     

2016年江苏省部分猪场猪伪狂犬病血清流行病学调查

2011年底,我国再次暴发猪伪狂犬病疫情,并造成严重经济损失。本研究采集2016年江苏省13个地市56个规模猪场的1 741份猪血清,采用伪狂犬病病毒（PRV）gE-ELISA、gB-ELISA抗体检测试剂盒进行血清学流行病学调查。调查结果显示：猪场PRV野毒抗体阳性率为94.6%（53/56）,血清gE抗体阳性率为43.2%,其中苏北地区显著高于苏中和苏南地区;公猪野毒感染阳性率为55%,后备母猪野毒感染阳性率高达69.4%;经产母猪野毒感染阳性率为44%,gE抗体阳性率与母猪胎次密切相关。结果表明：猪伪狂犬病在江苏省流行依然广泛,野毒感染较为严重,尤其是苏北地区;应重点关注种猪群,并加强伪狂犬病的疫苗免疫和抗体检测,从而更好地防控该病。     

2020年湖南及周边地区猪伪狂犬病病毒血清学调查及分析

为初步了解湖南及周边地区猪伪狂犬病免疫及野毒感染情况,于2020年1—12月从湖南及周边地区238个猪场采集血清样品7194份,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测伪狂犬病病毒(PRV)gB抗体和gE抗体.结果发现,667份血清样品为PRV-gE抗体阳性,5937份血清样品为PRV-gB抗体阳性,其平均阳性率分别...     

云南省楚雄地区散养户猪伪狂犬病野毒感染的血清学调查

为了解云南省楚雄地区散养户猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒感染的情况,试验从楚雄地区9个散养户随机采集154份血清样本,并应用间接ELISA方法对血清样本进行PRVg E抗体检测。结果表明:在154份猪血清中,抗PRV g E抗体的阳性率为25.32%。说明楚雄地区散养户PRV野毒株感染率偏高。     

检测猪伪狂犬病病毒gE抗体红细胞凝集试验的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)—猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病毒gE抗体的红细胞凝集试验。利用方阵滴定试验筛选出最佳抗原工作浓度为55μg/mL,血清最佳稀释度为1∶20,作用时间15 min,与猪瘟(CSF)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪乙型脑炎(JE)、猪布氏杆菌病(Brucellosis)阳性血清和PRV gE缺失疫苗接种的猪免疫血清均不出现红细胞凝集现象,与PRV标准阳性血清反应出现肉眼可见的凝集圈。与美国进口的PRV抗体检测gE-ELISA诊断试剂盒检测结果比较,50份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。     

猪伪狂犬病毒gB抗原侧向层析快速检测试纸条的研制

为建立一种简便、快速、特异的猪伪狂犬病毒(PRV)gB抗原检测方法,利用单克隆抗体技术和侧向层析(LFA)技术,采用柠檬酸三钠还原法,制备颗粒大小为31.5 nm胶体金,再用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体10D4,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处,分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体6E9,组装成LFA方法通用胶体金层析试纸条。经测试,该试纸条最低能检测出1:640倍稀释的,TCID_(50)为1×10~(8.6)/0.1 mL的灭活PRV抗原,并与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无交叉反应,特异性良好;室温干燥密闭的条件下,该试纸条至少可保存10个月。结果表明,本研究建立的试纸条方法操作简单、快速、敏感、特异,易于判定,适合基层PRV的大面积普查和现场检测。     

一例农户小型种猪场伪狂犬病的净化

某农户小型种猪场疑似感染伪狂犬病病毒,为了检测出野毒感染猪,净化伪狂犬病,提高猪群健康水平,采用PRV gE抗体ELISA检测试剂盒,对该场免疫了猪伪狂犬病基因缺失疫苗的猪群进行5次野毒感染检测;同时应用实时荧光PCR检测试剂盒,对有临床症状的新生仔猪进行PRV病原检测。经过连续监测、综合防控并适时淘汰,该猪场的PRV野毒感染率降为1.72%,发病仔猪伪狂犬病毒野毒阳性率均降为零。猪场新生仔猪成活率提高,猪群基本无PRV感染,净化效果良好。     

河南省部分种猪场公猪PRV野毒感染和精液中PRV检测的研究

为了解种猪场公猪感染伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)野毒和精液中PRV散毒情况,自2016年10月至2018年3月,我们对河南省22家猪场的219头杜洛克公猪的血清进行了PRV野毒g E抗体检测,同时对这219头公猪相对应的219份杜洛克精液样本进行PRV-g E基因的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测。结果显示:这22家猪场中有2家猪场的公猪PRV野毒g E抗体和精液中PRV-g E基因的PCR检测结果均为阴性;在20家PRV野毒g E抗体检测阳性的猪场中,PRV野毒感染率最低为44.44%,最高为100%;在22家猪场中,公猪PRV野毒平均感染率为79.45%,精液中通过PCR可检测到PRV野毒的平均比例为20.55%;在PRV野毒g E抗体检测结果为阳性的公猪中,25.86%的公猪可通过PCR方法检测证明其精液携带PRV的野毒。结果说明河南省受调查猪场公猪感染PRV比率较高,但PRV野毒g E抗体阳性的公猪通过PCR技术能在精液中检测到阳性的比率较低。     

2018年崇左市不同规模猪场伪狂犬病免疫及野毒感染的血清学调查

为了解广西崇左市伪狂犬病(PR)免疫情况和伪狂犬病毒(PRV)野毒感染及分布情况,于2018年从崇左市内53个不同规模的猪场共采集猪血清样品1 222份,通过ELISA方法检测伪狂犬病免疫抗体和野毒感染抗体。结果显示:崇左PRV gB蛋白免疫抗体阳性1 096份,阳性率为89.69%;PRV野毒感染抗体阳性200份,阳性率为16.37%;PRV野毒感染猪场阳性20个,猪场阳性率为37.74%(20/53)。按小、中、大规模猪场统计:gE蛋白抗体阳性率分别为27.39%(132/482)、11.48%(65/566)、1.72%(3/174);PRV gE蛋白抗体阳性猪场率分别为44.83%(13/29)、33.33%(6/18)、16.67%(1/6)。本次监测结果说明:崇左市规模猪场PRV免疫效果好,但部分规模猪场,特别是小规模猪场已经普遍存在PRV野毒感染。