叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库构建及其分析

 【目的】研究叶锈菌诱导小麦叶片的基因表达情况,从分子水平阐明小麦的抗病机制。【方法】以小麦抗叶锈病近等基因系TcLr41为材料,利用抑制差减杂交技术,构建叶锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,随机挑取文库中的阳性克隆测序,并对测序结果进行功能注释和分类。【结果】成功构建了叶锈菌诱导的小麦叶片抑制差减杂交文库,共获得3 456个阳性克隆。挑取165个阳性克隆进行测序,获得160条高质量EST。对EST序列进行聚类后,共获得107条非重复序列（Unigene）,与GenBank进行BLASTx和BLASTn同源比对,其中70条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的65.4%。已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、转录调控及抗病防卫等多方面。【结论】通过对功能已知的基因分析,推测促分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase）、GTP结合蛋白（GTP-binding protein）、钙网蛋白（calreticulin）、过氧化氢酶（catalase）、谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase）、多聚泛素基因（polyubiquitin）、锌指蛋白（zinc-finger protein）、肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase）、转脂蛋白（lipid transfer protein）、类甜蛋白（thaumatin-like）、几丁质酶（chitinase）等可能参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。     

草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制,构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在长期生理试验的基础上,通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,挑选部分阳性克隆进行测序,并对所获得的差异基因序列进行分析,研究了在38℃/30℃(昼/夜)培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;两个文库的基因片段的长度分布在200~900 bp,平均片段长度约500 bp左右;在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序,共得到100个有效序列,其中38个是未知序列,其余62个为已报道序列,但是序列功能全部未知,这些EST中有25个与叶绿体染色体有关,其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序,可为高羊茅耐热基因的研究提供依据,同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。     

白粉病菌诱导的小麦抑制差减文库构建与杂交点阵膜制备

 以本实验室培育的抗白粉病品系“百农 32 17×Mardler”BC5F4为材料 ,构建了一个白粉病菌诱导的抑制差减杂交cDNA文库。建库过程质量分析表明 ,差减杂交效率较高 ,文库质量较好。文库滴度为 4 .2× 10 9cfu·ml-1;插入片段平均为 30 0bp左右。挑取文库阳性克隆 96 0个 ,扩增插入片段 ,将其制备成高密度杂交点阵膜。通过探针杂交检测表明 ,本研究制备点阵膜的方法简便可靠 ,获得的点阵膜可用于抗病相关基因的筛选研究     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实,以及适温条件下有籽的子房和果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆;测序、序列拼接后,共获得1 248个高质量的unigenes;将其与非冗余数据库BLAST比对后,有1 109个unigenes找到同源序列,139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释,其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条,分析表明,茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部,单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库,获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes,包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

枯萎病菌诱导的节瓜抑制差减cDNA文库的构建

以抗枯萎病节瓜品种杂交20号为材料,利用抑制差减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.beniacasa)诱导的节瓜SSH-cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。得到正向差减文库的滴度为3.64×105 CFU/mL,反向差减文库滴度为6.80×105 CFU/mL;正向和反向差减文库的重组率均大于90%,插入片段在400～800bp之间。     

鸡白痢和肠炎沙门氏菌抑制差减文库的构建与分析

应用抑制差减杂交技术(SSH)对鸡白痢沙门氏菌C79-13与肠炎沙门氏菌50041进行基因组片段的差异分析,构建鸡白痢沙门氏菌的差减文库。经Dot-blot筛选,并对部分片段进行测序和同源性分析。结果表明:这些序列主要分为3类,即型分泌系统相关序列、质粒转移相关序列、未知功能序列。其中2个差减片段与编码福氏志贺菌侵入质粒抗原IpaJ蛋白基因的同源性达50%。证明所构建的差减文库可为鸡白痢沙门氏菌特异性致病基因和其致病机理的研究提供重要的依据。     

应用抑制性差减杂交技术分离椪柑枯水相关基因

【目的】探索椪柑枯水分子机理,寻找柑橘枯水应答基因,为柑橘枯水防治奠定基础。【方法】利用抑制性差减杂交技术以椪柑正常果肉cDNA作为Driver,以枯水果肉cDNA作为Tester构建正向差减文库。【结果】挑选了300个有效克隆进行测序分析,260个测序成功。经BLASTx比对分析,197条表达序列标签（ESTs）找到了分属于52个基因的同源序列;63条ESTs同源性较低或没有同源性。对文库中编码β-微管蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素c、半胱氨酸蛋白酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、转运蛋白、天冬氨酸蛋白酶前体、WRKY转录因子21的基因进行实时定量RT-PCR验证,结果显示这8个基因均明显上调表达。这些差异性表达基因主要涉及衰老、抗逆防御、几丁质和细胞壁代谢、蛋白降解等过程。【结论】通过构建椪柑果肉枯水正向文库,得到一些与枯水相关的基因,这些基因反映了果实对枯水的调控情况,可作为今后防治枯水病害的候选基因。     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

山东省大白菜软腐病菌种群分布的研究

对山东省6个地区的143个菌株的形态、生理生化特性进行了鉴定,结果表明:山东省大白菜软腐欧文氏菌存在四种类型,分属于胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种Erwiniacarotovorasub sp.carotovo-ra(Ecc)、胡萝卜软腐欧文氏菌黑胫亚种E.carotovorasub sp.atroseptica(Eca)、胡萝卜软腐欧文氏菌山葵亚种E.carotovorasub sp.wasabiae(Ecw)和菊欧文氏菌Erwiniachrysantherni(Ech)。田间出现的频率分别为70.0%、11.1%、0.6%和19.3%,以Ecc为优势种群。     

抑制差减杂交法克隆小麦抗病基因相关片段研究

以YW642/中8601的F2代纯合的抗病和感病单株各10株提取DNA构建成近等基因池,以抗病池为试验方,以感病池为驱动方,进行抑制差减杂交(SSH),构建差减文库。结果表明,用差异筛选排除假阳性,得到8个阳性克隆;Southern杂交表明,克隆TSH-1具有抗病池特异性,且为寡拷贝或单拷贝序列;经测序,TSH-1长388bp,提交GenBank进行Blast比对,没有找到与之同源的序列。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞,并可使被感染细胞发生转化,体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库,筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料,提取总RNA和mRNA,反转录合成cDNA;然后分别作为tester和driver,进行抑制性消减杂交（SSH）,构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库;对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序,共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条,大小主要分布在350-1 200 bp之间;将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对,其匹配于192条基因序列;其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列;其中已有功能注释的ESTs 285条,再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析,结果表明,宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外,通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析,结果表明,肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术,成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库,筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因,并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因,为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。     

草原红牛和中国荷斯坦牛肌肉组织SSH文库的构建及初步分析

利用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)方法构建了中国草原红牛与中国荷斯坦牛背最长肌差异表达消减c DNA文库,共获得859个差异表达克隆,对全文库进行了测序并与Gen Bank数据库进行比对分析。结果表明:共获得789个新ESTs,84个未知功能蛋白基因,356个已知功能蛋白基因。在已知功能蛋白基因中,表达上调的基因有123个,表达下调的基因有233个。差异表达基因可能与肉质性状有关,可以作为肉质性状的候选基因进行深入研究。     

表油菜素内酯诱导大白菜抗软腐病研究

试验采用叶面喷施的方法,研究了24-表油菜素内酯(24-Epibrassinolide,EBR)对大白菜软腐病的诱抗作用及其生理机制。结果表明,外源EBR处理大白菜幼苗病情指数明显比对照降低,下降了25.8%;喷施EBR提高了大白菜叶片中H2O2含量,使丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量下降,提高了过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性,过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性先缓慢升高然后下降;接种软腐病菌后,EBR使H2O2和MDA含量缓慢增加,但EBR处理MDA含量低于对照处理,显著提高了CAT活性,POD活性与对照相比下降,呈现缓慢升高趋势;EBR处理明显促进幼苗的生长,即使在接种软腐病菌期间,植株的长势也比对照强。说明EBR通过调节植物体内氧的代谢平衡,增强对软腐病的抗性。     

不育温度下油菜温敏雄性不育系SSH文库的构建

 以温敏雄性不育系K121S在可育温度（10℃）下和不育温度（26℃）下三核期花蕾为材料,以可育温度下的cDNA为驱动子,通过抑制性差减杂交技术构建了不育温度下抑制性差减杂交（SSH）文库,其插入片段长度分布在200~1 000 bp左右,并随机挑选97个阳性菌落测序,得到20个表达序列标签（EST）,包括与ATP合酶β亚基、Rubp羧化酶小亚基同源的EST等,为进一步获得育性转换相关基因和揭示K121S的育性转换分子机理奠定了基础。     

Isolation and Analysis of Drought-Induced Genes in Maize Roots

Maize roots are important component for plant adaptation to soil water deficits because they are supposed to take up water and necessary solutes from the soil. In the present study, the drought-induced genes were isolated in maize roots. A suppression subtractive hybridization protocol was applied to construct a forward subtractive cDNA library from CN165 for drought-stressed maize roots and a number of drought-induced genes were isolated. Totally, 126 uniESTs （containing 82 singlets and 44 contigs） were obtained from 503 available ESTs sequences after macroarray hybridization. UniESTs were analyzed using BLASTN and BLASTX and the results showed that 92% of the uniESTs had homolgous sequences in maize nr database by BLASTN. About 89% of uniESTs appeared the homlogous amino acid sequences in rice protein database but not in maize protein database by BLASTX, implying that those genes are likely new functional genes in maize. Function analysis showed that those genes were involved in a broad spectrum of biological pathways, mainly in signaling and regulatory pathways related to stress tolerance.     

设施栽培番茄软腐病的鉴别、发生和防治研究

根据田间发生症状和病原观察,初步鉴别认为引起番茄萎蔫的病害为番茄软腐病(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)。设施栽培番茄软腐病多发于番茄植株茎部,呈灰褐色条斑、湿腐,病部维管束无损,严重的髓部腐烂,有异味,病茎上端萎蔫,植株枯死。病原菌体呈短秆状,Φ1.3~1.8μm×0.6~0.9μm,周生鞭毛6根,明显有别于细菌性番茄髓部坏死病、番茄青枯病和番茄溃疡病等。上海地区,温室番茄秋季定植,11月下旬初发病,翌年1月上、中旬和4~5月病势发生迅速,直至7月拉秧。该病在农事操作、整枝打杈、扎蔓和生长过程中的生理开裂等引起的伤口处易发生侵染。加强农业栽培生态管理措施,必要时选用药剂涂抹、喷雾或浇灌等措施,能有效地控制病害的发生。     

草鱼肠道组织差异表达基因消减文库的构建

以致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)人工感染的1龄草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道组织为材料,应用抑制性差减杂交技术,构建了肠道组织的消减cDNA文库.以草鱼管家基因β-actin作为差减指标检测文库差减效率达2~(10)倍,表明感染细菌后某些差异表达基因得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到A/T载体,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞.