人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。     

重组鸡β-防御素5 - β-防御素10双分子蛋白的构建及其理化特性分析

鸡抗菌肽属禽β-防御素（AvBD）类,是鸡先天性免疫的重要组成部分。研究将AvBD10基因定向插入到AvBD5-pGEX SalⅠ和NotⅠ双酶切位点上,构建了AvBD5-pGEX- AvBD10双基因共表达重组载体。将重组质粒转化大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21,于37 ℃不同时间进行诱导表达,SDS-PAGE检测外源基因的表达。结果表明,重组AvBD5-AvBD10双分子融合蛋白的分子量约为36 kD,重组双分子蛋白占菌体总蛋白的35%,重组菌表达产物以包涵体形式存在。重组双分子蛋白经纯化后,分别以对数生长中期的大肠杆菌[BL21(DE3-) 株]与致病性链球菌［Streptococcus（CAB株）］为检测菌,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组双分子蛋白的抗菌活性,结果表明,重组双分子蛋白对这两种细菌都具有抗菌活性。并且对温度和pH有很高的稳定性,在-70～100 ℃或pH 3～12处理30 min仍具有抗菌活性。     

鸡β-防御素-1真核表达载体构建及其在Flp-In-293细胞中的表达

以防御素为研究对象探讨其药用开发价值已是国内外生物医学研究领域的热点之一,鸡β-防御素-1（Gallinacin-1,Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用,具有很好的研究开发价值。本研究以含有Gal-1成熟肽全长cDNA的重组质粒pMD19-T-Gal-1为模板,通过PCR在Gal-1成熟肽基因C末端引入6×His-tag,并将其克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His;经脂质体介导转染Flp-In-293细胞,48h后间接免疫荧光分析,结果重组质粒pcDNA3.1（＋）-Gal-1-His转染的Flp-In-293细胞中有绿色荧光,而阴性对照中无荧光,表明Gal-1-His在Flp-In-293细胞中得到了表达。本研究结果将为进一步研究Gal-1的功能奠定基础。     

胡须鸡β-防御素Gal-1-Gal-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少.     

牛胎儿成纤维细胞β-防御素(hBD3)基因转染及转基因克隆胚制备

用脂质体法将含有人β防御素3（hBD3）和绿色荧光蛋白（EGFP）基因的乳腺特异性表达载体pEBB导入牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选和PCR鉴定获得阳性细胞,将这些转hBD3基因的阳性细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞,进行PCR鉴定,获得转基因克隆胚,再将这些转基因克隆胚移入64头受体牛子宫,现有21头转基因克隆胚胎的受体牛妊娠3个月。本研究为获得转人β防御素3（hBD3）基因牛克隆胚、制作转基因克隆牛,及预防奶牛乳房炎的发生提供了可行的技术。     

胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布术

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1（Ga1-1）-Gallinacin-13（Ga1-13）共13个基因编码区全长片段。通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为：DQ858311-DQ858323。比较分析胡须鸡13种β-防御素Ga1-1（a）-Ga1-13,Ga1-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性,均在96．5％-100％之间。利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Ga1-1、Ga1-1（a）、Ga1-2、Ga1-3、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7、Ga1-8、Ga1-12和Ga1-13在同一大的分支上;Ga1-9和Ga1-10在同一分支;Ga1-11独在一分支上。用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Ga1-1－Ga1-13基因在不同组织中的分布,结果发现：Ga1-1、Ga1-2、Ga1-4、Ga1-5、Ga1-6、Ga1-7和Ga1-10的表达分布非常广泛,Ga1-3、Ga1-8、Ga1-9、Ga1-11、Ga1-12和Ga1-13的分布少。     

半滑舌鳎转化生长因子TGF-β1和TGF-β3基因的克隆及受哈维氏弧菌感染后表达分析

转化生长因子β (transforming growth factor β,TGF-β)是一类具有多种功能的蛋白超家族,在细胞免疫、细胞增殖分化和组织损伤的修复中起着关键性作用.本研究从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肝脏中克隆获得了TGF-β1和TGF-β3基因.推导的TGF-β1和TGF-β3氨基酸序列均含有多个N糖基化位点和一个TGF-β家族标签.系统进化树分析显示,半滑舌鳎TG F-β1和TGF-β3分别与鱼类的TGF-β1和TGF-β3亲缘关系最为密切.qRT-PCR结果表明,半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因在健康鱼的多个组织中均有表达,二者在皮肤中表达量最高,在肌肉中表达量最低.经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后,TGF-β1在肝脏、脾脏和肾脏中呈现先上升后下降的表达趋势,在感染48 h后的肝脏中表达量达到最大值,是对照组的3.17倍;TGF-β3在脾脏、肾脏和鳃中也呈现先上升后下降的表达趋势,在感染24 h后的鳃中表达量达到最大值,是对照组的4.71倍.以上结果提示,TG F-β1和TGF-β3可能在半滑舌鳎抵御细菌感染的免疫中发挥了重要作用,本研究为证明二者参与机体免疫调节提供了有力证据,为半滑舌鳎分子免疫研究提供了理论依据.