禽流感病毒N3亚型神经氨酸酶基因的克隆

本研究应用11日龄SPF鸡胚增殖禽流感病毒标准株A/Duck/Germany/1215(H2N3),用LSTRIAZOLL试剂盒提取病毒RNA,应用自行设计的NA基因半特异性引物进行RT-PCR扩增,得到NA基因的全长DNA片段,克隆到PMD18-T载体上,并进行鉴定和序列测定.测定结果表明所获得的NA基因DNA片段长1451bp,编码469个氨基酸残基,与其他亚型的NA基因编码的氨基酸长度相一致.根据推导的氨基酸序列进行预测,该蛋白具有6个潜在的糖基化位点和19个半胱氨酸残基.与其他亚型的NA基因相比较发现克隆的NA基因符合神经氨酸的分子结构特征,本研究首次获得N3亚型NA基因全序列.     

H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及表达

根据已知H9N2亚型禽流感病毒神经氨酸酶(NA)基因序列设计,合成克隆引物。自H9N2亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增NA基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NA,分子量约54·7ku。经免疫印迹及ELISA分析重组NA的免疫反应性和免疫动物分析其免疫原性,结果表明:重组NA能与H9N2亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免疫动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

禽流感病毒N1和N2亚型神经氨酸酶RT-PCR鉴别方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的禽流感病毒(AIV)N1、N2亚型神经氨酸酶基因设计了2对引物，建立了一种RT—PCR鉴别方法，其目的片段大小分别为358bp、377bp。经对A／goose／Guangdong／1／96(H5N1)、A／Turkey／England／N28／73(H5N2)、A／African starling／983／79(H7N1)和A／Turkey／Wiscosin／1／66(H9N2)病毒株的鸡胚尿囊液样品进行扩增，扩增片段的大小与预期大小完全相符。经对国内不同地区分离的16株AIV N1亚型和21株AIV N2亚型用RT-PCR方法检测，阳性检出率分别为87．5％(14／16)和95．2%(20／21)；对50份样品进行盲检，准确率为98％(49／50)。     

云南2008～2009年H9N2亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因序列分析

禽流感病毒血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒粒子表面抗原,是亚型划分的重要依据。从云南分离的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡胚尿囊液中提取总RNA,采用特异性引物经RT-PCR分别扩增云南毒株10个HA和9个NA基因,纯化后克隆至pMD18-T载体,并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明:云南H9N2毒株HA基因核苷酸序列同源性为95.0%～99.7%;NA基因核苷酸序列同源性为86.2%～99.6%。在进化分枝中HA基因均属于欧亚分枝的类CBJ194亚分枝,与CBJ194的核苷酸序列同源性为92.0%～99.1%,NA基因属于CK/BJ/1/94和QaHKG1/97两个分枝。云南毒株HA裂解位点结构具有低致病性病毒分子特征;HA受体结合位点143、145、198和234位氨基酸存在变异,尤其234位氨基酸全部变为L,呈现了人流感受体结合特性。NA糖基化位点61～63、86～88部分毒株存在缺失,部分毒株在143～145位出现新的糖基化位点。     

广西鸭源H6N6亚型禽流感病毒HA和NA基因的序列分析

为了明确H6亚型禽流感病毒在广西地区的流行情况,广西自治区动物疫病预防控制中心从健康家鸭体内分离鉴定了一株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/GX/038/2009 (H6N6) (Dk/GX/038/09),对其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因进行了克隆和序列分析,并绘制了基因遗传进化树.结果显示,Dk/GX/...     

一株番鸭源N6亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

为了丰富水禽源流感病毒神经氨酸酶基因（NA）的分子流行病学资料,通过对2008年分离自福建省某种番鸭1株罕见的H6N6亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）NA基因进行克隆分析,发现该毒株NA基因全长为1431bp,开放阅读框为1380bp（19～1398）,其中从第175～207位缺失33个核苷酸：其编码459个氨基酸,颈部存在有11个氨基酸的缺失（TNSTTTIINNN）,为在N6亚型神经氨酸酶基因中首次报道有颈部缺失。该NA基因和我国分离的A／duck／Eastern China／01／2007（H4N6）NA基因的核苷酸同源性最高,达97．1％,并处在同一遗传进化分支上;与其它H6N6亚型AIV分离株NA基因的同源性均较低,同源性处在78．3％到79．6％之间,相互之间遗传关系较远,其它H6N6亚型AIVNA基因在遗传进化上呈独立进化分支。     

禽流感病毒神经氨酸酶的研究进展

神经氨酸酶是禽流感病毒的两种表面糖蛋白之一,是一种由AIV基因组第6节段编码的Ⅱ型糖蛋白。宿主细胞膜上的唾液酸（SA．又名神经氨酸）是流感病毒的主要受体。流感病毒与宿主细胞膜上SA受体结合后,才能进入细胞。而神经氨酸酶可以降解AⅣ识别的宿主细胞膜上的受体,抑制病毒进入细胞。神经氨酸酶的这一独特功能特点使其成为国内外抗禽流感病毒研究的热点之一,同时也为制备抗禽流感转基因家禽提供了理论依据。本文简要综述了禽流感病毒的背景知识,着重介绍了神经氨酸酶的结构与功能以及目前国内外神经氨酸酶的研究状况,并对其今后的研究和应用进行展望。     

华东地区家鸭中N2亚型低致病性禽流感病毒神经氨酸酶基因的重排

为研究华东地区家鸭中低致病性禽流感病毒NA基因的遗传进化规律,对2000年～2006年分离的包括H3N2,H5N2,H6N2,H9N2和H11N2的44株禽流感病毒的NA基因进行了遗传进化分析.44株病毒NA基因之间的同源性为82.9%～99.9%,4株H9N2病毒的NA基因同源性为96.9%～99.9%,所有H3N2病毒的NA基因同源性为92.3%～99.9%,H5N2、H6N2和H11N2病毒的同种亚型毒株间的NA基因同源性变化幅度较大,相反,有些不同HA亚型毒株间的NA基因同源性反而很高.进一步分析NA基因推导的氨基酸序列也表现出相似的规律.华东地区家鸭中N2亚型的禽流感病毒正处于不断地进化状态中,不同N2亚型的禽流感病毒之间已存在NA基因的重排.     

禽流感病毒神经氨酸酶的结构及其生物学功能

高致病性禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的一种急性传染病。AIV呈球形,有囊膜。其表面主要有2种糖蛋白,即血凝素和神经氨酸酶。其中神经氨酸酶具有重要功能,其对病毒的释放及病毒在感染细胞周围的扩散能力有很大影响。此外,神经氨酸酶对其周围的血凝素切割能力也有很大影响,从而在一定程度上可以导致病毒致病性的不同。神经氨酸酶是AIV中另一种重要抗原,抗神经氨酸酶的抗体可为机体遭受流感病毒攻击提供一定的保护力。因此,神经氨酸酶对AIV的生物学特性具有重要意义。     

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)的M基因进行克隆和序列分析。序列分析表明,该M基因全长1 027 bp,包含2个读码框,可分别翻译出M1和M22种蛋白质。M1由252个氨基酸残基组成,M2由97个氨基酸残基组成。与不同毒株比较,结果显示,该M基因与A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)同源性为100%,当A/Chicken/Guangxi/9/99(H9N2)同源性为99%,与A/Chicken/Guangdong/5/97(H9N2),A/Chicken/Guangdong/11/97(H9N2)等中国分离株同源性达98%。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。     

一株鸭源H1N6亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA和NA基因序列分析

为了解禽流感病毒（AIV）在广西中越边境地区的流行情况,本研究在该地区活禽市场开展禽流感病原监测。监测过程中分离鉴定出1株H1N6亚型禽流感病毒,命名为A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）,对其HA和NA基因进行序列测定,并与GenBank中下载的相关参考序列进行比对和遗传进化分析。结果显示,分离株HA基因与A/sparrow/Guangxi/GXs-1/2012（H1N2）的核苷酸同源性最高（96.9%）,NA基因与A/Pavo cristatus/Jiangxi/JA1/2016（H5N6）的核苷酸同源性最高（98.2%）。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSIQSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒分子特征;与部分N6亚型禽流感病毒一样,分离株NA基因有11个氨基酸缺失。此外,本研究还对分离毒株的受体亲和性进行了测定,结果显示该病毒优先结合唾液酸α-2,3-Gal受体。本研究结果表明A/Duck/Guangxi/F01/2016（H1N6）是一株重组低致病性禽流感病毒。     

1株H6N6亚型禽流感病毒贵州分离株HA和NA基因克隆与序列分析

为了解 H6亚型禽流感病毒(AIV)在贵州地区的流行情况,本研究对2014年从贵州省三穗鸭体内分离鉴定出的1株H6N6亚型AIV (A/duck/Guizhou/013/2014) HA和NA基因进行了克隆和序列分析。结果显示,A/duck/Guizhou/013/2014的HA基因与华东地区2009年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达97.5%,HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为P-Q-I-E-T-R-G,符合低致病性AIV的分子特征;而NA基因则与福建2007年鸭源H6N6亚型AIV同源性最高,达98.2%;由遗传进化树分析结果可知,HA和NA基因在遗传进化关系上,与湖南毒株位于同一分支,而与2007年贵州分离的3株H6N6亚型AIV不处于同一分支,说明A/duck/Guizhou/013/2014与本地区的H6N6亚型AIV亲缘关系较远。本研究结果表明当前贵州地区H6N6亚型AIV存在明显的遗传多样性。     

Cloning and Sequence Analysis of HA and NA Genes of One Strain of H6N6 Subtype Avian Influenza Virus Isolated from Guizhou Province

To investigate the epidemic situation of H6N6 subtype avian influenza virus (AIV) in Guizhou province,A/duck/Guizhou/013/2014 was isolated from Sansui duck in live poultry market of Guizhou in 2014,the hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) genes of DK/GZ/14 were subjected to clone and sequence analysis.The results showed that HA gene had the highest nucleotide homologies (97.5%) with the duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Eastern China in 2009,and the strains of HA gene proteolytic cleavage sites was P-Q-I-E-T-R-G,which accordeol with the molecular characteristic of low pathogenic AIV (LPAIV).However,NA gene of A/duck/Guizhou/013/2014 had the highest nucleotide homologies (98.2%) with the duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Fujian in 2007.The phylogenetic tree showed that A/duck/Guizhou/013/2014 and Hunan strains located in the same branch,while three duck-origin H6N6 subtype AIV isolated from Guizhou in 2007 and A/duck/Guizhou/013/2014 located in the different branch for HA and NA genes in genetic evolution,which suggested that A/duck/Guizhou/013/2014 was far with the local H6N6 subtype.The results also clearly indicated that duck-origin H6N6 subtype AIV had genetic diversity in duck population in Guizhou.     

H4亚型禽流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备

以H4亚型AIV分离株A/鸭/扬州/185/2003免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行融合,经血凝抑制(HI)试验筛选并克隆后,获得能够稳定分泌抗体的单克隆细胞株:2C11、6E7、4C8和5C5。4株单抗腹水的HI效价在2~(12)～2~(15),单抗亚类均为IgG2a。4株单抗均能与感染了H4亚型AIV的MDCK细胞发生间接免疫荧光(IFA)反应。并且,均不与其他亚型AIV、NDV、IBV和EDS-76病毒发生HI反应。另外,4株单抗均能使病毒失去感染细胞的能力,显示出良好的中和特性。单抗HI反应谱表明,2C11、4C8、6E7和5C5分别可以抑制10株H4亚型AIV中9、8、7和7株病毒的血凝反应,且均不能抑制A/鸭/苏州/1/2002毒株的血凝作用。     

63株H9N2亚型禽流感病毒NA基因序列分析

为了从分子水平上掌握我国H9N2亚型禽流感病毒NA基因变异情况和流行规律,作者汇集了我国部分省市的63株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其NA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得序列进行同源性和进化分析。结果显示分离株核苷酸同源性在87.4%~99.5%;52株NA蛋白颈部63—65位点缺失了T、E、I 3个氨基酸,属于Y280-like分支,11株没有发生缺失,属于G9-like分支,没有发现G1-like分支和Y439-like分支的NA基因毒株;唾液酸结合位点(HB)和抗原决定簇的氨基酸发生了明显的变异;酶活性位点处的氨基酸非常保守,没有发生与抗神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦和扎那米韦相关的氨基酸突变;36/63毒株失去了402位点处的潜在N-糖基化位点;而28/63毒株新出现了264位点处的潜在N-糖基化位点。本研究提示目前中国大陆地区商业鸡群流行的H9N2亚型禽流感病毒NA基因分为2个差异较大分支——Y280-like分支和G9-like分支,而Y280-like分支仍是我国H9N2亚型禽流感病毒流行的主要类型。     

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.0/0.2 mL,对小鼠的LD₅₀为10^-4.67/0.05 mL。以10⁶ EID₅₀/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7 d死亡,感染后第7 天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×10⁵ EID₅₀/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。     

Pathogenicity of a Strain of H5N6 Subtype Avian Influenza Virus in Ducks and Mice

To investigate the pathogenicity of A/Hero/Guangdong/C1/2013(H5N6), an AIV strain isolated from Heron on ducks and mice, pathogenicity of this new virus strain and changing of histopathology as well as a preliminary study on its biological characteristics were studied by virus challenges test via intranasal and eye-drop and in chicken via jugular vein injection.Results showed that the EID₅₀ of this strain of virus was 10^-8.16/0.1 mL in embryonated chicken eggs and the intravenous inoculation of pathogenic index (IVPI) was 2.76.In ducks and mice, the 50% lethal doses (LD₅₀) of it were determined to be 10^-4.0/0.2 mL and 10^-4.67/0.05 mL, respectively.Symptoms of infection included loss of appetite, depression, swollen head and tears after being infected with 10⁶ EID₅₀ per duck by intranasal and eye-drop administration.Most of ducks died 4 to 7 days post-infection, liver, lung and kidney still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Anatomy showed symptoms of pericardial effusion, pulmonary congestion and kidney enlargement, while pathological section showed pathological change like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, liver, kidney and spleen.Mice developed symptoms of infection like loss of appetite, depression, shaggy coat and ruffled coat after being infected with 5×10⁵ EID₅₀ per mouse by intranasal and eye-drop administration.Most of the infected mice died 5 to 7 days post-infection and only liver still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Although organ anatomy showed no obvious pathological changes, pathological section showed pathological changes like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, kidney and lung.Our research demonstrated that this H5N6 subtype AIV had a strong pathogenicity and could be defined as a highly pathogenic AIV strain as its IVPI was greater than 1.2.Our work laid a theory foundation for study, prevention and control of H5N6 subtype AIV.     

H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景

H5N1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行,给禽类养殖业带来了巨大的经济损失。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前最为有效的预防措施和关键环节。因此,研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,且取得了大量的研究成果。作者从禽流感病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和RNAi技术应用等方面对H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状作一综述,归纳出该领域中存在的问题和不足,并对禽流感疫苗的应用前景作一展望,以期为深入进行禽流感的防制研究提供参考。     

H7N9亚型禽流感病毒三重PCR检测方法的建立

In order to develop a rapid and simultaneous assay for H7N9 subtype avian influenza virus （AIV）, three pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the hemagglutinin (HA) gene of H7 subtype AIV, the neuramidinase (NA) gene of N9 subtype AIV, and the matix (M) gene of all subtypes AIV. The reaction conditions were optimized, and the specificity and sensitivity of this method were evaluated to develop a triplex PCR assay. It was shown that H7N9 subtype AIV could be amplified into three specific bands by this triplex PCR, the lengths of these bands were 330 (H7 AIV), 207 (N9 AIV) and 632 bp (all AIV), respectively. Samples containing H7 or N9 subtype AIV could be amplified into two specific bands, which were 330 and 632, 207 and 632 bp, respectively. Samples containing other subtypes AIV could be amplified into a 632 bp specific band. No specific band was amplified from other avian pathogenic virus. Sensitivity test results showed that as low as 10³ copies/μL H7N9 subtype AIV could be detected. This triplex PCR could simultaneously diagnose H7N9 subtype AIV, single H7 subtype AIV, single N9 subtype AIV and other subtype AIV in one tube. This assay was a rapid, specific and sensitive method for the detection of H7N9 subtype AIV. It could be applied in rapid diagnosis for clinical samples, and also provided a technical support to prevent and control H7N9 subtype AIV.