猪圆环病毒2型重组Cap蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

利用pET32a(+)-Cap重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA方法用于检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果表明,抗原最适包被浓度为4μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,37℃封闭3 h,血清最适稀释度为1∶200,其作用时间为60 min,酶标抗体最适稀释度为1∶20 000,最适作用时间为30 min,37℃显色15 min,判定血清样品P/N≥2.1,且OD450≥0.228为阳性。该方法与猪瘟、猪口蹄疫、猪脑心肌炎、猪呼吸与繁殖综合征病毒阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果变异系数均值分别为5.65%和5.81%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法对123份血清样品进行检测,检测结果阳性率78%,与国产商品化试剂盒检测结果对比,符合率为91.9%,表明本试验建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性,适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。     

猪圆环病毒2a型和2b型Cap蛋白的原核表达及鉴定

为制备猪圆环病毒2a型（PCV2a）和2b型（PCV2b）Cap蛋白,用生物信息学软件优化PCV2a Cap基因和PCV2b Cap基因密码子、克隆至p ET28a载体中、转化BL21(DE3)、构建重组蛋白表达菌株,通过优化原核表达的温度、IPTG浓度等条件进行蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果显示：重组PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白的分子量约为30 k Da,在不同温度下都以包涵体形式存在,在37℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达的Cap蛋白表达量最高。试验成功制备了PCV2a-Cap蛋白和PCV2b-Cap蛋白,为制备PCV2二价疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组耐热新城疫病毒的构建及免疫原性

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,给全球养猪业造成了巨大的经济损失.为研发新型PCV2疫苗,采用反向遗传操作技术,以耐热低毒的新城疫病毒TS09-C株为载体,将PCV2主要免疫原蛋白Cap以单独编码框的方式插入至TS09-C株的基因P和M之间,为增强Cap蛋白在载体内的高效...     

抗猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

本试验旨在为PCV2的快速诊断提供技术手段。用纯化的原核表达的重组猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白(pET-Cap)免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得了2株能够稳定分泌抗pET-Cap抗体的杂交瘤细胞株3D5和5C5。经建立的间接ELISA试验检测3D5、5C5细胞上清效价分别为1∶2048、1∶1024;诱生腹水的效价分别为 1∶204800、1∶102400,杂交瘤染色体数目分别为95条、96条。Western blotting结果表明,2株单抗能与病毒发生特异性反应。传代培养20代,3个月内复苏冻存3次,3D5、5C5能够稳定分泌抗体。     

应用猪圆环病毒2型缺失NLS的Cap蛋白建立一种ELISA检测方法

本试验通过诱导重组质粒pCold-SUMO-dCap在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性表达的SUMO-dCap融合蛋白,以SUMO-dCap融合蛋白作为包被抗原,建立了一种检测猪圆环病毒2型抗体的ELISA方法。用该方法与商品化试剂盒对267份猪血清进行平行检测,两种方法的符合率为90.26%,该方法的特异性和灵敏性分别为93.33%、97.16%;与猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒和猪瘟病毒阳性参考血清无交叉反应;批内和批间变异系数分别为1.25%⁶.37%和6.68%6.37%和6.68%¹3.58%。研究结果表明,本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性好、重复性高,为临床上PCV2血清抗体检测和PCV2流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法,为商品化试剂盒开发奠定了良好的基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的研制及其应用

以真核表达的猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白所形成的病毒样颗粒作为免疫原,按照常规方法免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经间接ELISA法和间接免疫荧光试验（IFA）筛选,总共获得了4株分泌抗PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为7A6、3F2、3B7、1A6。4株单抗腹水效价均达到1:10⁵。IFA和免疫过氧化物酶单层实验结果显示,4株单抗均能与PCV2发生特异反应,与PCV1无交叉反应。PCV2 Cap蛋白单克隆抗体的制备,为猪圆环2型病毒抗原表位分析及其相关抗原抗体诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

重组新城疫病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的研究

为构建表达猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白(Cap)的重组新城疫病毒(NDV),本研究利用NDV LaSota弱毒疫苗株为活病毒载体,通过反向遗传操作系统构建出表达PCV2 Cap的重组病毒(rLa-PCV2/Cap),以及表达删除核定位信号(NLS)的Cap(Cap△41)的重组病毒(rLa-PCV2/Cap△41),并对外源蛋白的表达效果进行了检测.通过间接免疫荧光试验证明,两种重组病毒感染的BHK-21细胞中,PCV2 Cap蛋白以及删除NLS的Cap△41蛋白均获得正确表达;其中,完整的Cap蛋白定位于核内,而删除NLS的Cap△41蛋白则定位于胞浆中,本研究结果为研究新型PCV2疫苗奠定基础.     

表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建及鉴定

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了猪圆环病毒2型Cap蛋白,并对该蛋白的生物活性进行鉴定。PCR获得Cap基因并克隆入pFastBacTMⅠ载体质粒,重组质粒pFastBacⅠ-Cap转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-Cap。以脂质体法将重组杆粒转染对数生长期的Sf9细胞,获得重组杆状病毒。电镜下可见典型的杆状病毒,SDS-PAGE显示,重组病毒表达的Cap蛋白约28ku,间接免疫荧光试验证明,Cap蛋白良好表达并具有免疫反应性,为猪圆环病毒亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

猪2型圆环病毒Cap蛋白在伪狂犬病病毒中的表达

用EcoR Ⅰ酶切伪狂犬病病毒疫苗株Tk-/gE-/LacZ 基因组,与含有猪2型圆环病毒(PCV2)ORF2基因的重组转移载体pIEORF2共转染IBRS-2细胞.收集病变细胞,经空斑纯化和PCR鉴定,获得了新的重组病毒Tk-/gE-/ORF2 .用Southern blot杂交证明该重组病毒构建正确,用间接免疫荧光法和Western blot证日月该重组病毒可表达PCV2的主要免疫原性蛋白Cap蛋白.重组病毒在IBRS-2细胞上连续传15代后,遗传稳定.该重组病毒在IBRS-2细胞上增殖滴度为10-7.1 TCID50/0.1mL,在鸡胚成纤维细胞上增殖滴度为10-4.8 TCID50/0.1mL,在Marc-145细胞上增殖滴度为10-6.8 TCID50/0.1mL.     

猪圆环病毒2型CaP蛋白的表达及在ELISA中的初步应用

本研究旨在建立以PCV2 Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因原核表达质粒pET32a-ORF2并转化至Rosetta菌,在1.0 mmol·L-1 IPTG和37℃条件下诱导下,Cap蛋白获得高效表达,Western blot检测证实其具有免疫反应活性,以纯化的蛋白为抗原建立了检测猪圆环病毒2型抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原最适包被浓度为2.16μg·mL-1;血清最佳稀释度为1:40;抗原最佳包被条件为4℃过夜;最佳封闭条件为1%BSA 37℃1 h;血清反应时间为37℃30 min;酶标二抗最适作用时间为37℃45 min;底物最佳反应条件为37℃显色15 min.用该方法对四川省184份猪血清样品进行检测,总阳性率为80.98%(149/184),与商品化的PCV2 ELISA试剂盒得到的结果基本一致.本试验成功建立了PCv2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测.     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

基于PCV3-Cap蛋白间接ELISA检测方法的建立及临床应用

为了建立一种敏感和特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法,对PCV3-Cap蛋白抗原表位预测发现其抗原表位多聚集在C端(羧基端),而N端前33氨基酸为核定位序列。以截断N端前120个氨基酸后的PCV3ORF2序列为靶基因,设计引物。以PCV3阳性病料为模板,PCR扩增截短的ORF2基因,并将其克隆至pET-30a载体构建重组质粒,并转染至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞,获得重组菌后选择最佳诱导表达条件,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达产物。以纯化后的重组Cap蛋白作为包被抗原,建立PCV3间接ELISA (indirectELISA)诊断方法,并初步用于临床样品检测。结果:从阳性病料中扩增出大小为285bp的PCV3ORF2基因片段,重组质粒经双酶切和测序鉴定构建成功。采用1mmol·L-1 IPTG诱导,在37℃条件下培养6h重组菌,重组蛋白获最佳表达。Western blot结果表明,该重组蛋白与PCV3阳性血清具有较好的反应原性。ELISA的最佳包被抗原质量浓度为1μg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1∶20,酶标抗体最佳工作浓度为1∶5 000。阳性判定值为S/P≥0.273。批内和批间系数均小于10%,表明该方法具有较好的重复性。PCV2阳性血清用本方法检测为阴性,表明该方法有较好的特异性。检测采集的439份临床猪血清,PCV3抗体阳性检出率为60.59%(266/439)。结果表明,本研究建立了一种快速、简便、敏感、特异的猪圆环病毒3型(PCV3)抗体检测方法。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白的截短表达与活性检测

本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状病毒表面的展示

本试验将猪圆环病毒2型(PCV2)去核定位区ORF2基因克隆到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC中,转化DH10Bac大肠杆菌感受态,经抗性及蓝白斑筛选得到含ORF2基因的重组杆状病毒DNA,以脂质体介导法将此重组DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。对重组病毒进行Western-blot分析和免疫金电子显微镜检测。结果表明,PCV2 Cap蛋白在重组杆状病毒中获得表达;免疫金电子显微镜观察表明,重组蛋白展示在杆状病毒囊膜上。本试验成功构建表面展示PCV2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用重组杆状病毒作为亚单位疫苗奠定基础。