玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种的遗传多样性、致病力与毒素化学型分析

【目的】明确中国玉米穗腐病致病禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）的菌群遗传结构、致病力、毒素化学型及其相互关系,为玉米镰孢穗腐病防控提供参考信息。【方法】从中国玉米主产区采集玉米穗腐病样本,经单孢分离鉴定,选取代表性的禾谷镰孢复合种,利用22对SSR和10对VNTR引物,使用Popgen32、NTsys2.1、STRUCTURE2.3.4群体遗传学研究软件进行数据分析,结合TEF-1α、β-tubulin和RPB2基因测序构建系统发育树,分析7个地理区域禾谷镰孢复合种的遗传多样性,采用花丝通道注射接种法测定各镰孢菌的致病力,利用产毒基因特异性引物进行毒素化学型的检测。【结果】在禾谷镰孢复合种中共检测到等位位点数48个,多态性位点数39个,多态性条带比率为81.25%,每对引物扩增出多态性条带2—4条;禾谷镰孢复合种7个地理群体平均Shannon’s信息指数和Nei’s遗传多样性指数分别为0.41和0.29,7个地理区域遗传相似度集中在0.6677—0.8797,遗传距离为0.1282—0.4039,表明菌群间具有较丰富的遗传多样性。依据Nei’s遗传距离对7个地理种群进行UPGMA聚类分析,可划分为3个类群;STRUCTURE2.3.4群体结构分析表明,禾谷镰孢复合种菌群被分为2个大类群最合适,西北地区绝大部分属于类群A,华中地区和华南地区菌株均属于类群B,东北地区50%以上菌株属于类群B。TEF-1α、β-tubulin和RPB2基因序列分析表明禾谷镰孢复合种由禾谷镰孢（F. graminearum）、亚洲镰孢（F. asiaticum）、布氏镰孢（F. boothii）和南方镰孢（F. meridionale）构成,上述镰孢菌中存在142个单核苷酸多态性位点（SNP）,通过这些差异序列构建的聚类图能清楚显示出各个种内与种间的遗传分化情况,各镰孢种内遗传多样性十分丰富。禾谷镰孢致病力最强,平均发病面积百分比为20.79%;亚洲镰孢、布氏镰孢和南方镰孢的平均发病面积百分比分别为15.79%、11.77% 和 8.12%。统计分析表明,不同镰孢种所引起的穗腐病平均发病面积占比存在显著差异。禾谷镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV和3ADON+15ADON+NIV 4种,以15ADON为主;布氏镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、NIV、3ADON+15ADON和3ADON+15ADON+NIV 5种,以15ADON为主;亚洲镰孢毒素化学型只有3ADON;南方镰孢毒素化学型为15ADON、3ADON、15ADON+NIV 3种,15ADON为优势类型。此外,15ADON、NIV和3ADON毒素类型菌株平均发病面积百分比分别为17.87%、17.20%和12.37%。【结论】我国不同地理区域尤其是相邻区域禾谷镰孢复合种菌群间存在较为频繁的基因交流与交换。本研究中禾谷镰孢复合种的主要毒素化学型为15ADON,致病力由强到弱依次为禾谷镰孢>亚洲镰孢>布氏镰孢>南方镰孢。整体看来,毒素化学型与菌种类型相关性不显著,致病力主要与菌种类型有关。     

黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌及优势种分析

【目的】 明确黄淮海夏玉米主产区玉米茎腐病的主要病原菌组成及优势种,为病原菌致病机制、抗性育种及茎腐病防治提供依据。【方法】 于2014—2017年采集黄淮海夏玉米主产区3个省（河北、河南、山东）的玉米茎腐病样本850份。通过形态学、通用引物和特异引物对病组织分离物进行鉴定,并采用上述引物直接检测病组织。整合分析分离物鉴定法和组织分子检测法的结果以确定玉米茎腐病的主要病原菌及优势种;分析主要病原菌在各省间以及同一省份不同年度的检出率,揭示主要病原菌的种群动态变化;分析单个样本中病原菌的检出率,探讨多种病原菌的共存模式。【结果】 有667份样本检测出真菌或卵菌,占总样本的78.47%;年度间样本检出率存在差异,2014年的检出率不足50%,而2015—2017年的检出率相近,均高于90%。在所有样本中共检出20属46种真菌或卵菌,其中镰孢菌（Fusarium spp.）的检出率最高,为89.96%,包括禾谷镰孢复合种（F. graminearum species complex）、层出镰孢（F. proliferatum）、拟轮枝镰孢（F. verticillioides）、厚垣镰孢（F. chlamydosporum）、亚粘团镰孢（F. subglutinans）、尖镰孢（F. oxysporum）、黄色镰孢（F. culmorum）、藤仓镰孢（F. fujikuroi）、变红镰孢（F. incarnatum）、木贼镰孢（F. equiseti）和茄镰孢（F. solani）11个种;腐霉菌（Pythium spp.）的检出率为34.18%,包括芒孢腐霉（P. aristosporum）、禾生腐霉（P. graminicola）、棘腐霉（P. acanthicum）、孤雌腐霉（P. amasculinum）和寡雄腐霉（P. oligandrum）5个种。拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢为4种主要病原菌,检出率依次为62.07%、46.93%、29.09%和28.04%,其中拟轮枝镰孢为优势种。各省之间,上述4种主要病原菌的检出率存在一定差异。拟轮枝镰孢在河北省的检出率为73.98%,明显高于该菌在河南省和山东省的检出率;禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率分别为35.78%和34.31%,均高于在其他两省的检出率。同一省份不同年度上述4种主要病原菌的检出率呈动态变化,其中任何一种病原菌均有可能上升为优势种。进一步分析表明,单个样本中可以检测出一种或多种病原菌,检测出1种菌的样本占38.38%,检出2种和3种病原菌的样本分别占29.24%和19.04%;2种及以上病原菌共存以镰孢菌和腐霉菌、镰孢菌和镰孢菌模式为主。【结论】 黄淮海夏玉米主产区茎腐病主要病原菌为拟轮枝镰孢、禾谷镰孢复合种、芒孢腐霉和层出镰孢,其中拟轮枝镰孢为优势种;拟轮枝镰孢在河北省的检出率最高,层出镰孢和芒孢腐霉在山东省的检出率最高,禾谷镰孢复合种在3个省的检出率相近;单个样本中存在多种病原菌共存的模式。     

东北地区玉米穗腐镰孢菌种类鉴定及拟轮枝镰孢菌遗传多样性

为明确东北地区玉米穗腐病致病镰孢菌的种类及拟轮枝镰孢菌的多样性,于2015~2016年在东北4个省30个区县进行玉米穗腐病样品的采集,通过形态学及分子生物学方法对分离获得的镰孢菌的种类进行鉴定,并用ISSR分子标记技术对40株拟轮枝镰孢菌进行遗传多样性分析。结果表明:在获得的122株镰孢菌分离物中鉴定出包括禾谷镰孢菌、层出镰孢菌、亚粘团镰孢菌和拟轮枝镰孢菌共4个种,其分离频率分别为4.92%、7.38%、10.66%和77.05%。从区域分布来看,拟轮枝镰孢菌的分布最广,在所有采样县区均有分布。在30个县区采集的玉米穗腐病样品中,有7个县区分离到亚粘团镰孢菌,有5个县区分离到层出镰孢菌,有2个县区分离到禾谷镰孢菌,分别占采集县区样本的23.33%、16.67%和6.67%,说明拟轮枝镰孢菌是东北地区玉米穗腐病的优势致病菌。ISSR-PCR结果表明,筛选出的8条ISSR引物共扩增出45条清晰条带,其中27条为多态性条带,不同引物对供试菌株扩增的条带数不同,引物842扩增的条带最多,引物873扩增的条带最少,多态性条带的比例分别是66.7%和50%。聚类分析结果表明,供试菌株间的遗传相似系数为0.75~1.00,当遗传相似系数为0.97时,供试菌株被全部分开。拟轮枝镰孢菌ISSR类群的划分与其地理来源没有明显的相关性。     

我国部分常用玉米种质资源对镰孢菌病害的抗性评价

【目的】玉米穗腐病、茎腐病和鞘腐病是我国玉米产区普遍发生的三大镰孢菌（Fusarium spp.）病害,近年来有严重混和发生的趋势,三大病害主要致病菌分别为拟轮枝镰孢（F. verticillioides）、禾谷镰孢（F. graminearum）和层出镰孢（F. proliferatum）。种植抗病品种是控制该类病害最经济有效的方法,本研究旨在筛选出单抗或兼抗穗腐病、茎腐病和鞘腐病的玉米种质,为玉米品种的科学选育和合理布局提供参考。【方法】选取我国玉米种质B73、B37、郑58、昌7-2、齐319等16个常用育种自交系,将玉米穗腐病主要病原菌拟轮枝镰孢、茎腐病主要病原菌禾谷镰孢及鞘腐病主要病原菌层出镰孢分别接种于玉米果穗、茎秆及叶鞘,具体方法为待整株长到吐丝期用连动注射器将拟轮枝镰孢孢子悬浮液沿花丝通道注射到健康玉米果穗;将健康玉米地上第一节的茎部用针扎孔后向其中注射禾谷镰孢孢子悬浮液;将层出镰孢孢子悬浮液沿健康玉米植株叶基部接种到地上2—5节间的叶鞘内。以上各种接种方式均使用无菌水作为对照。在2016年和2018年度进行人工田间接种试验,通过评价穗腐病、鞘腐病的病情指数以及茎腐病发病面积,评估所选自交系对以上镰孢菌引起的穗腐病、茎腐病和鞘腐病的抗性级别。【结果】供试自交系中吉853、OH43和X178对穗腐病表现为中抗,B73、B37、PH6WC、掖478、郑58、9058、昌7-2、浚928、Mo17、A619、PH4CV、齐319和13-1077共13份材料为感病或高感;齐319、PH4CV、Mo17、9058、B37、B73、昌7-2和13-1077共8份材料对茎腐病表现为中抗或高抗,郑58、掖478、PH6WC、浚928、吉853、A619和OH43共7份材料表现为感病或高感;B73、B37、郑58、掖478、PH6WC、9058、昌7-2、吉853、浚928、Mo17、A619、PH4CV、OH43、齐319和13-1077共15份材料对鞘腐病表现为中抗或抗病。从16个自交系所在种群来看,瑞德群对穗腐病表现为感病,兰卡斯特群和唐四平头群对鞘腐病表现为抗病,其他群对3种镰孢菌病害抗性水平的离散程度较大,无明显规律。【结论】供试自交系吉853和OH43对鞘腐病和穗腐病表现为中抗或抗性,齐319、PH4CV、Mo17、9058、B37、B73、昌7-2和13-1077共8份材料对鞘腐病和茎腐病表现为中抗、抗性或高抗,但尚未筛选到对3种病害均有较好抗性的材料,有待于进一步筛选其他种质资源。     

吉林省玉米穗腐病致病镰孢菌的鉴定与部分菌株对杀菌剂的敏感性

【目的】明确吉林省玉米穗腐病主要致病镰孢种群分布及杀菌剂对镰孢菌菌丝生长的抑制效果,为针对性地开展玉米镰孢穗腐病的防治提供依据。【方法】通过组织分离法和分子生物学方法对2020年采自吉林省36个市(县)的149份玉米穗腐病样品进行病原菌分离鉴定，利用禾谷镰孢复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)毒素合成相关基因特异性引物检测其产生毒素的化学型，对部分禾谷镰孢复合种进行致病力测定；采用菌丝生长速率法测定7种杀菌剂对禾谷镰孢复合种的抑制效果。【结果】分离获得233株镰孢菌，隶属4个镰孢复合种，含9种镰孢菌，包括拟轮枝镰孢(F.verticillioides)、布氏镰孢(F.boothii)、禾谷镰孢(F.graminearum)、层出镰孢(F.proliferatum)、亚洲镰孢(F.asiaticum)、厚垣镰孢(F.chlamydosporum)、藤仓镰孢(F.fujikuroi)、木贼镰孢(F.equiseti)和亚黏团镰孢(F.subglutinans)，分离频率依次为33.05%、26.18%、25.32%、12.45%、0....     

山西省玉米穗腐病病原镰孢菌的分离与鉴定

为明确山西省玉米穗腐病的病原菌种类,采用常规组织分离法对山西省晋城市和太谷县的玉米穗腐病的病原菌进行了分离、纯化,从采集的玉米穗腐病病样中共分离到53个菌株,经形态学鉴定,分别为轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和半裸镰孢菌(Fusarium semitectum),其中轮枝镰刀菌F.verticillioides的分离频率为46.7%,属优势种群。致病性测定结果表明,轮枝镰孢菌与禾谷镰孢菌为山西省玉米穗腐病的病原菌,且两者复合侵染对玉米造成的为害最严重。这一结果为进一步研究和控制该病提供了可靠的理论依据。     

禾谷镰孢复合种毒素化学型及遗传多样性分析

【目的】明确不同省（自治区）引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种（Fusarium graminearum species complex,FGSC）的毒素化学型和它们之间的遗传差异以及亲缘关系。【方法】选用根据基因Tri13和Tri3序列设计的特异性引物分析来自11个省（自治区）的92株禾谷镰孢复合种菌株的毒素化学型;从100条哥伦比亚大学（UBC）开发的通用引物中筛选出13 条扩增条带丰富、重复性好、信号强、背景清晰的引物,利用筛选出的引物对供试菌株进行ISSR-PCR扩增,使用Popgen32软件计算多态性位点百分率、Shannon’s多样性指数、群体间的遗传距离和遗传相似性;依据Nei’s 遗传距离,利用NTsys2.10e软件进行UPGMA聚类分析,并构建供试菌株的聚类图。【结果】供试的92株禾谷镰孢复合种菌株的产毒素化学型有4种：DON、15-ADON、DON+15-ADON和NIV+15-ADON。其中产生DON和15-ADON的菌株分别为1株和20株;同时产生15-ADON和NIV的有1株;同时产生15-ADON和DON的有55株。筛选出的13条引物对所有供试菌株进行PCR扩增,共获得102条带,其中多态性条带101条,多态性比率为99.02%,平均每条引物产生条带为7.85条。在群体平均水平上,基因多样性指数（H）为0.3129,Shannon’s的信息指数（I）为0.4774,表明禾谷镰孢复合种存在较高的遗传多样性水平;不同地理种群间,各群体的遗传多样性水平具有一定差异,河北、山西、黑龙江和吉林种群遗传多样性最高,安徽和河南种群最低。地理种群间的基因分化系数（Gst）为0.2722,说明不同地理种群间存在一定的遗传变异,但大部分遗传变异（72.78%）发生在种群内。遗传分化系数估算的基因流值Nm=1.3372（＞1）,表明不同地理种群间存在一定的基因流动;遗传关系结果表明河北、山西、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古和甘肃菌株群体间亲缘关系较近,山东、江苏、河南和安徽菌株间亲缘关系较近,安徽和内蒙古菌株间的亲缘关系最远。聚类分析显示所有菌株相似系数为0.43-0.95。在相似系数为0.43时,所有菌株分成2大类群,Group 1包括4株北方春播区菌株（吉林、山西和河北张家口）,不产生NIV和DON;Group 2由余下的88株菌株构成,产生的毒素类型主要为DON和15-ADON,其来源于北方春播区（山西、黑龙江、吉林、辽宁、甘肃和河北张家口、唐山）和黄淮海夏播区（河北石家庄、河南、山东、江苏和安徽）,在相似系数为0.664时,各类群分成不同的亚群,亚群的结果与菌株来源有一定的相关性。聚类分析结果和毒素化学型分析显示,同一地理种群的菌株多数聚在一起,个别菌株分散到不同的分支上。【结论】北方春播区和黄淮海夏播区的禾谷镰孢复合种主要的毒素化学型为DON和15-ADON。引起玉米穗腐病的禾谷镰孢复合种菌株群体内存在丰富的遗传变异,不同地理种群间存在一定的基因交流,遗传多样性与地理来源有关。     

玉米茎腐、鞘腐、穗腐病中不同镰孢菌间关系研究

【目的】为了明确不同镰孢菌对玉米茎腐病、鞘腐病和穗腐病的致病性。【方法】采用土壤接菌、穿刺接菌和孢子悬浮液接菌的方法。【结果】证明层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)、轮枝镰孢菌(F.verticillioides)可引起玉米茎腐病,禾谷镰孢菌(F.graminearum)可引起穗腐病、鞘腐病,而尖孢镰孢菌(F.oxysporum)则通过复合侵染引起病害。【结论】将各类镰孢菌分别接种不同生育期的玉米植株,观察株高、病斑大小、玉米发育程度和籽粒的形成情况,研究各镰孢菌菌株对玉米植株的影响程度,分析各菌株的致病力,最佳侵染时期及茎腐、鞘腐、穗腐之间的侵染关系,证明玉米茎腐、鞘腐、穗腐之间病原菌侵染部位没有特异性,不同时期侵染引起的茎腐、鞘腐及穗腐发病程度不同。     

对改良玉米自交系多种穗腐病的抗性鉴定与评价

2022年应用2种人工接种方法对79份改良的自交系进行玉米拟轮枝镰孢穗腐病、玉米禾谷镰孢穗腐病、玉米木霉穗腐病、玉米青霉穗腐病的抗性鉴定与评价。结果表明,大部分自交系对玉米拟轮枝镰孢穗腐病、禾谷镰孢穗腐病、青霉穗腐病抗性较好,对木霉穗腐病抗性表现中等。经筛选得到兼抗4种穗腐病的多抗性种质12份,为抗病品种的选育提供了重要材料。     

玉米抗穗腐病研究进展

玉米是世界上最重要的农作物之一,中国玉米总产量占全国所有谷物产量的38.12%。穗腐病是玉米生产中的重要病害,在降低玉米产量和品质的同时,产生的毒素也危害人畜安全。抗性品种的选育和利用是控制玉米穗腐病的经济、安全和有效措施。目前,国内外对玉米穗腐病的致病菌进行了较为详细的研究,鉴定出40余种病原真菌,其中拟轮枝镰孢、禾谷镰孢和黄曲霉引起的穗腐病发生普遍,危害最为严重。建立了4种玉米抗穗腐病鉴定的方法,即双牙签接种法、花丝喷雾法、花丝通道注射法和针刺果穗注射法,从数千份玉米种质资源中筛选出一批抗拟轮枝镰孢、禾谷镰孢或黄曲霉穗腐病的材料。明确了玉米抗穗腐病的物理与生化机制,主要表现为抗侵染和抗扩散两个方面。对部分材料进行了抗性遗传分析和抗性基因QTL定位研究,在玉米1-8号染色体上检测到60余个抗黄曲霉侵染或抑制黄曲霉毒素积累的QTL;定位了55个抗拟轮枝镰孢穗腐病、29个抗禾谷镰孢穗腐病、16个抗伏马毒素和DON毒素的QTL,并通过meta-QTL分析获得了数个能稳定表达且贡献率较大的QTL位点。创制了10余份抗穗腐病种质,育成了少数对穗腐病具有较好抗性的玉米新品种。尽管如此,抗性研究和抗病育种成果用于生产实践的事例仍很少,生产上缺乏抗穗腐病且高产优质的玉米品种。本文从玉米穗腐病病原类型、抗性种质筛选与评价、抗性遗传及抗性基因的发掘与分子定位、抗性机制、抗病品种的选育等方面对国内外玉米抗穗腐病研究进行了综述,并对今后的相关研究进行了展望,以期对促进玉米抗穗腐病研究有所裨益。     

Resistance Evaluation of Some Commonly Used Maize Germplasm Resources to Fusarium Diseases in China

【Objective】 Maize ear rot, stalk rot and sheath rot are the three common Fusarium diseases in maize producing areas in China, and there is a trend of serious mixing occurrence in recent years. The main pathogens of the three major diseases are F. verticillioides, F. graminearum and F. proliferatum. Planting resistant varieties is the most economical and effective method to control this kind of diseases. The objective of this study is to screen out the maize resistant germplasms to ear rot, stalk rot and sheath rot, and to provide references for scientific breeding and rational layout of maize varieties.【Method】 Sixteen common inbred lines of maize including B73, B37, Zheng 58, Chang 7-2, Qi 319 and so on were selected to inoculate F. verticillioides, F. graminearum, and F. proliferatum on maize ears, stalks and sheaths, respectively. The suspension spores of F. verticillioides were injected into healthy maize ears along the filament channel with a continuous syringe at silk stage. The stem of the first aboveground segment of healthy maize was pinned and then injected with the suspension spores of F. graminearum. The suspension spores of F. proliferatum were injected into the sheath of the aboveground 2-5 internodes along the base of healthy maize sheath. Sterile water was used as control. In 2016 and 2018, experiments were conducted in fields to evaluate the disease index of ear rot, sheath rot and the lesion areas of stalk rot, so as to evaluate the resistance level to the ear rot, stalk rot and sheath rot.【Result】 The tested inbred lines Ji 853, OH43 and X178 were moderate resistance to ear rot, 13 of the tested inbred lines such as B73, B37, PH6WC, Ye 478, Zheng 58, 9058, Chang 7-2, Xun 928, Mo17, A619, PH4CV, Qi 319 and 13-1077 were sensitivity or high sensitivity to ear rot; 8 of the tested inbred lines including Qi 319, PH4CV, Mo17, 9058, B37, B73, Chang 7-2 and 13-1077 were moderate resistance and high resistance to stalk rot, 7 of the tested inbred lines such as Zheng 58, Ye 478, PH6WC, Xun 928, Ji 853, A619 and OH43 were sensitivity or high sensitivity to stalk rot; 15 of the tested inbred lines such as B73, B37, Zheng 58, Ye 478, PH6WC, 9058, Chang 7-2, Ji 853, Xun 928, Mo17, A619, PH4CV, OH43, Qi 319 and 13-1077 were moderate resistance or resistance to sheath rot. According to the population of 16 inbred lines, Reid group was susceptible to ear rot. Lancaster group and Tangsipingtou group were resistant to sheath rot. The resistant levels of other groups to Fusarium diseases dispersed to a large extent, and there was no obvious regularity.【Conclusion】 The tested inbred lines Ji 853 and OH43 showed moderate resistance or resistance to sheath rot and ear rot, 8 of the tested inbred lines including Qi 319, PH4CV, Mo17, 9058, B37, B73, Chang 7-2 and 13-1077 showed moderate resistance, resistance or high resistance to sheath rot and stalk rot, but the materials with good resistance to all three diseases had not yet been screened, and other germplasm resources needed to be further screened.     

化学防控玉米蛀穗害虫对减轻拟轮枝镰孢穗腐病及伏马毒素的作用

【背景】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）引起的穗腐病严重影响玉米产量和品质,其产生的伏马毒素威胁食品安全。亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和桃蛀螟（Conogethes punctiferalis）等穗期害虫危害可导致玉米严重减产,并加重玉米穗腐病的发生。【目的】评估2种杀虫剂（甲维盐和氯虫苯甲酰胺）、3种杀菌剂（氰烯菌酯、戊唑醇和苯醚甲环唑）对玉米穗期病虫害的防治效果以及对玉米产量和籽粒中伏马毒素含量的影响;明确施用杀虫剂后接菌对穗腐病发病的影响,探究防治玉米穗期病虫害的有效方案,为玉米安全生产提供技术支撑。【方法】以郑单958为供试玉米,在2019年春、夏两季于河北廊坊进行田间试验。玉米大量吐丝后5 d和20 d两次施药,接菌处理于吐丝后7 d进行。在玉米完熟期调查虫害级别、穗腐病发病率和病情指数、果穗穗长、行粒数、穗重和百粒重,计算防治效果和增产情况,并用高效液相色谱-串联质谱法分析籽粒中伏马毒素B1、B2的含量。【结果】与对照相比,施用甲维盐和氯虫苯甲酰胺均可显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量。与单独施用杀虫剂相比,施用杀虫剂与杀菌剂的混剂未显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量,也未显著提高产量和对上述病虫害的防治效果。与仅接菌的处理相比,施用氯虫苯甲酰胺后接菌处理在穗腐病发病率、病情指数和伏马毒素含量方面均显著下降。在春玉米和夏玉米试验中,25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果分别达82.1%—92.7%、94.2%—95.0%,而30 g·hm^-2甲维盐及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果显著低于25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺,仅为57.8%—78.0%、83.1%—89.9%。2种杀虫剂对穗腐病的防治效果无显著差异,春玉米防治效果均>60%,夏玉米防治效果均>88%。对于产量而言,各处理均对果穗穗长和行粒数无显著影响,药剂处理后的果穗穗重均显著高于对照,且各处理间无显著差异。施用杀虫剂后接菌对产量无显著影响。分别施用2种杀虫剂单剂或其与杀菌剂的混剂后,春玉米可增产5.49%—13.49%,夏玉米可增产9.20%—13.95%,玉米籽粒中伏马毒素含量均低于500 μg·kg^-1,而对照玉米中伏马毒素含量达2 817 μg·kg ^-1。喷雾接菌处理的玉米中伏马毒素含量高达8 710 μg·kg ^-1,而接菌前施用杀虫剂可将伏马毒素含量降至1 500 μg·kg ^-1以下。【结论】施用25 g·hm^-2氯虫苯甲酰胺和30 g·hm^-2甲维盐均可通过显著降低玉米蛀穗害虫的危害,从而减轻穗腐病的发生并降低籽粒中伏马毒素含量,提高玉米产量和品质,而杀虫剂/杀菌剂混用与杀虫剂单用对虫害防控效果差异不显著;穗期害虫对果穗的伤害在穗腐病的发生过程中起决定性作用。综合各方面因素,25 g·hm^-2的氯虫苯甲酰胺是防治穗期玉米害虫、减轻穗腐病较为理想的药剂。     

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一，论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异，为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序，之后采用生物信息学分析，分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考，以|log₂FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因，利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1 945个基因上调表达，有9、302和1 784个基因下调表达；玉米分别有293、692和1 426个基因上调表达，320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示，侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长，差异基因主要富集在...     

基于宿主诱导的基因沉默技术创制抗拟轮枝镰孢玉米自交系

【目的】拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioide）是一种主要的病原真菌,侵染玉米可以导致穗粒腐病、茎腐病、苗期根腐病及引起种子腐烂。由拟轮枝镰孢引起的病害不仅影响玉米的产量和品质,而且其病原菌代谢过程中产生的伏马菌素等多种真菌毒素严重威胁了人畜安全。通过宿主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术创制抗拟轮枝镰孢的玉米种质,为玉米抗病育种提供新的优异抗源。【方法】通过同源克隆方法克隆可能与拟轮枝镰孢生长发育相关的关键基因,并通过体外转录获得相应的dsRNA片段;将不同基因的dsRNA与拟轮枝镰孢的分生孢子悬浮液预混后,用于后续的体外RNA沉默试验;对感病玉米自交系西502的种子进行消毒与接种,在培养皿中28℃避光培养48 h,调查种子的发病程度;在混有dsRNA的孢子悬浮液中加入葡萄糖,25℃培养24 h后,在显微镜下观察孢子萌发与菌丝生长情况;将三叶期的西502幼苗转移至预混dsRNA的孢子悬浮液中进行培养,7 d后观察苗期根腐病发病状况;通过种子鉴定与苗期鉴定体系,逐步筛选具有显著抑制效果的沉默靶标基因;合成筛选出的重点靶标基因片段,构建沉默载体并转化感病玉米自交系西502;对转基因株系的种子接种鉴定,验证转化玉米株系的抗性;提取接种后转基因种子的总RNA,对拟轮枝镰孢的靶标基因进行荧光定量分析,确定HIGS株系的沉默效果。【结果】从拟轮枝镰孢中克隆出18个与其生长发育相关的候选基因;通过种子接种鉴定,发现11个候选基因被沉默后,种子的发病等级极显著降低;进一步筛选出6个沉默后影响拟轮枝镰孢的孢子萌发和菌丝生长的候选靶标基因deo、Ras2、Dpdc、Hsp90、Frp1和Atg15;通过苗期接种鉴定,最后筛选出3个在体外具有显著抑制效果的沉默靶标基因deo、Atg15和Frp1;进而将3个靶标基因的特异区段人工融合成一段序列并构建沉默载体,获得转基因植株;鉴定发现转基因植株的T₂代种子对拟轮枝镰孢的抗性显著增强,且3个靶标基因的表达量均显著下降。【结论】拟轮枝镰孢基因deo、Atg15、Frp1与其生长发育密切相关,且沉默后能够显著提升玉米对拟轮枝镰孢的抗性。     

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记的拟轮枝镰孢ATMT（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation）突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠（cefotaxime sodium,Cefo）和氨苄青霉素钠（ampicillin sodium,Amp）对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B（hygromycin B）的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因（GFP）、潮霉素抗性基因（HPH）的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150 μg·mL ^-1时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150 μg·mL ^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP（登录号：LC420351.1）的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。 【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。