全基因组重测序在大豆育种上的研究进展

大豆是世界上最重要的油料作物之一。随着基因测序技术的快速发展及广泛应用,大豆育种研究受到了深刻的影响。本文简述了基因测序的主要方法及全基因组重测序在大豆育种、遗传转化研究中的应用,综述了目前全基因组重测序从发现突变位点、揭示进化关系、挖掘功能基因等基因功能和结构的角度,来研究大豆育种及疾病发生过程中的分子机理,为今后基因测序技术在大豆育种中的研究与应用提供参考。     

基于全基因组重测序技术的甘蓝型油菜光叶突变体基因定位

表皮蜡质是油菜适应逆境的保护措施之一。本课题组前期报道了一个由1对显性基因控制的甘蓝型油菜(Brassica napus L.)光叶突变体DL22B077-1。为了进一步了解其遗传机制,本研究利用全基因组重测序技术和分离群体分析法(bulk segregated analysis,BSA)通过F₂群体进行基因定位,获得的有效碱基数达10 661.75 Mb,其中,Q₃₀均值为92.99%,平均作图率为97.73%,平均测序深度为24×,平均覆盖率为82.06%,测序质量较高;此外,分析了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记和插入-缺失(insertion-deletion,In-Del)标记与光叶性状的相关性。通过SNP标记,在5条染色体上得到7个相关区域和1 509个相关基因。通过In-Del标记,在11条染色体上得到15个相关区域和2 633个相关基因。SNP标记和In-Del标记关联分析结果的交集部分为C8染色体上8.60～10.39 Mb区域,总长度为1.79 Mb,共计130个候...     

大豆疫霉基因组SSR标记开发

 【目的】开发大豆疫霉基因组SSR标记,为从分子水平深入研究大豆疫霉及其近缘种提供一种理想的分子标记。【方法】用FPCR软件从大豆疫霉全基因组序列中查询SSRs,选择合适的SSR序列用Primer5.0软件设计引物。【结果】从发现的1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSRs中选出260段设计引物,经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测,有213对(81.9%)扩增出SSR特征条带,其中114(53.5%)对引物扩增出多态性。通用性检测表明,14.6%～28.6%引物分别在选择的8个疫霉种中有效扩增。基于10个SSR标记数据进行聚类分析,结果表明表明这些标记可以完全区分大豆疫霉及其它疫霉。【结论】大豆疫霉基因组SSR标记具有高多态性,是大豆疫霉遗传变异、遗传多样性、及遗传图谱构建等研究理想工具。部分大豆疫霉基因组SSR标记在其近缘种中具有通用性,可以用于疫霉菌的系统进化、鉴定、区分及开发近源种的SSR标记。特别开发的SSR标记,在大豆疫霉基因组中具有准确的位置,将极大地方便大豆疫霉菌功能基因的定位和克隆,以及进行疫霉菌的比较基因组的研究。     

基于重测序的不同生态型油梨的全基因组变异及进化分析

为揭示不同生态型油梨间的差异,对4份不同生态型油梨进行全基因组重测序,平均测序深度为26×,平均覆盖度为89.39%。通过与参考基因组比对,4份不同生态型油梨平均杂合率为64.26%。除了西印度群岛生态型油梨品种Donnie的杂合率最低（为35.34%）外,剩下3份油梨品种的杂合率均超过70%。单核苷酸多态位点（SNP）数量为3 854 384～6 290 629个,小片段插入与缺失（Small InDel）总数为1 432 406～1 707 608个,这些突变导致了13 864～18 143个基因的变异。KEGG分析表明,淀粉和蔗糖的代谢通路在4份不同生态型油梨中均存在最多的变异基因。聚类分析表明,相对于西印度群岛生态型,危地马拉和墨西哥生态型油梨品种亲缘关系更近。研究结果在一定程度上反映了不同生态型油梨在基因组水平的差异,为分子标记辅助选择育种提供了科学依据。     

芒果炭疽病抗感品种全基因组重测序分析

为挖掘芒果基因组上抗病性遗传信息,本研究以芒果炭疽病高抗品种金煌、高感品种爱文为材料进行全基因组重测序,分别获得5.58 Gb和4.73 Gb原始数据量,测序深度为15.01×和13.73×,基因组覆盖度分别为92.23%和92.27%。以“红象牙”品种的基因组为参考基因组,爱文和金煌分别检测到3 316 161、3 075 003个单核苷酸多态性(SNP)位点,244 686、201 520个插入缺失(InDel)位点。对2个样本间DNA水平变异基因进行KEGG、KOG、NR、SwissProt数据库注释,分别发现28 981、17 151、30 013、22 910个变异基因,其中信号转导途径、植物-病原互作代谢途径、水杨酸代谢过程及其他次级代谢物的生物合成存在变异基因。对2个样本间变异基因进行筛选发现与植物抗性相关的重要基因存在变异,其中包括RGA2、RPM1、DSC1、NBS-LRR、At4g27190等抗病蛋白基因的变异以及含NB-ARC结构域的蛋白质、含BTB/POZ结构域和锚蛋白重复序列的NPR1蛋白基因的变异等。本研究结果在一定程度上反映了芒果抗感炭疽病品种在基因组水平...     

蓝莓基因组SSR分子标记开发

基于蓝莓(Vaccinium spp.)基因组DNA开发简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)分子标记25对,并采用17份蓝莓试材评价其多态性,结果表明,上述SSR位点的等位基因数量介于3～9个,平均等位基因数约为4.96个,信息指数平均值为1.055 2。此外,遗传多样性分析结果表明,17份蓝莓试材被分为4个组;其中,A组包含12份蓝莓试材,为最大分支;而C组和D组分别仅包含1份蓝莓试材,其遗传亲缘关系与其他试材相距较远。本研究开发的SSR引物能为蓝莓遗传多样性研究、新品种鉴定提供借鉴。     

利用全基因组重测序技术研究182份大麦和青稞的基因组结构变异

为探明大麦(Hordeum vulgare L.)和青稞(Hordeum vulgare var.nudum)基因组结构变异与表型和环境适应差异的遗传机制,以大麦基因组为参考,基于182份大麦和青稞样品的全基因组重测序数据,进行了基因组结构变异分析。结果表明:182份大麦和青稞样品的平均测序深度约为12 X,共获得74 262个结构变异,包含48 078个缺失(65%)、13 461个插入(18%)、7 012个倒位(9%)和5 711个染色体内易位(8%)。大麦参考基因组18.72%(7 440/39 734)的基因位于结构变异区内。许多与基因组结构变异相关的基因参与了光系统和防御反应过程。研究认为,基于182份大麦和青稞的基因组结构变异分析结果将为大麦和青稞建立一个比较完善的结构变异数据集,并将加深对大麦和青稞物种进化和表型差异分子机制的认识。     

‘鲁丽’ב红1#’苹果杂交群体全基因组KASP标记开发及验证

【目的】利用‘鲁丽’ב红1#’亲本及杂交后代,开发苹果叶片性状竞争性等位基因特异PCR(kompetitive allele-specific PCR,KASP)标记,为苹果光能高效利用育种提供参考。【方法】以‘鲁丽’和I型红肉苹果‘红1#’及其134个杂交后代的幼嫩叶片为材料,调查叶片性状表型（包括叶片长度、宽度、叶绿素含量、花青苷含量、光合参数和叶绿素荧光参数等）数据。采用Illumina HiSeq 2500测序平台进行全基因组重测序,通过短序列比对软件将测序序列（reads）回贴到苹果参考基因组,利用GATK软件工具包检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNP）标记。【结果】‘鲁丽’和‘红1#’及其134个杂交后代重测序得到有效reads数分别为164 776 660、149 482 876和3 927 370 200。与苹果参考基因组比对率分别为98.77%、98.89%和97.79%。共检测到6 445 766个SNP。经过滤后获得94 208个特异性强,准确性高的SNP位点。对每个SNP进行KASP引物设计,最终开发了5...     

大豆高蛋白基因分子标记辅助育种的应用

为了在周口地区大豆遗传背景的基础上筛选出有效的高蛋白基因分子标记,选用高蛋白大豆周豆25号和高油周豆18号作为亲本杂交构建F₂分离群体,选择144对SSR引物,运用BSA方法进行大豆高蛋白基因SSR分子标记筛选,并利用Mapmaker/Exp V3.0软件构建分子连锁图谱和定位分析。结果表明,在亲本间具有多态性引物32对;这32对引物在高、低蛋白基因池间有4对引物(satt182、satt419、satt239、satt598)表现多态性,但这4对引物与蛋白相关的标记不连锁,其中,引物satt182贡献率最高(3.1%)。利用标记satt182对来自河南、北京等地的50份高蛋白大豆材料进行检测,验证分子标记辅助育种方法的有效性,结果显示,50份大豆材料中检测出38份与相应的特异性条带相同,检测符合度为76.0%,检测结果有效性较高、准确性较好。     

基于全基因组重测序分析中国地方鸡的群体结构和保护优先权

[目的]旨在对中国本土鸡品种群体结构和保护优先权进行分析,促进畜牧业的可持续健康发展。[方法]收集了8个品种、共96个个体的重测序数据。通过主成分PCA分析、构建系统进化树及近交和遗传距离分析来了解群体结构,计算去除每个品种后总体基因和等位基因多样性的增减、模拟计算品种对具有最大基因多样性和最大等位基因多样性合成群体的贡献占比,进而系统评估品种保护优先权。[结果]所研究的品种可分为4个集群,其中藏鸡与其他品种分化最高,其自身分为2个亚群,其他品种则分为南北2个集群。藏鸡对遗传多样性的贡献最大;其次是文昌鸡和瑶鸡,此三者应考虑作为优先保护的品种。[结论]该研究结果将可为地方鸡品种保护与开发利用提供参考。     

大豆蛋白质和油分含量QTL定位及互作分析

【目的】定位大豆蛋白质和油分含量QTL及互作分析,为大豆品质性状QTL精细定位和分子辅助育种提供基础。【方法】以Charleston和东农594为亲本,构建了含147个株系的重组自交系,以F2:19-F2:20代重组自交系为试验材料,利用Windows QTL Cartographer V. 2.5软件的复合区间作图法和多重区间作图法,对该群体的蛋白质和油分含量进行QTL定位分析,并利用QTL Network 2.1软件分析QTL间的上位性效应及环境互作效应。【结果】采用CIM和MIM 2种算法在2011和2012年哈尔滨、红兴隆、佳木斯和牡丹江每年3个地点共6个种植环境下共定位了9个蛋白质和11个油分含量QTL。蛋白质含量QTL分布在6个连锁群,分别在A1、C2、D1a、G、H和O连锁群上,对表型效应的贡献率为5.3%-18.6%,在H连锁群上的qPro-H-1贡献率最大,为18.6%,在D1a连锁群上的qPro-D1a-2贡献率最小,为5.3%,在单种植环境下有5个蛋白质含量QTL被2种算法同时检测到,分别是qPro-O-1、qPro-A1-1、qPro-D1a-1、qPro-D1a-2和qPro-C2-2。油分含量QTL分布在8个连锁群,分别在A1、A2、B1、C2、D1a、E、L和M连锁群上,对表型效应的贡献率为7.1%-24.4%,在B1连锁群上的qOil-B1-2贡献率最大,为24.4%,在C2连锁上的qOil-C2-3贡献率最小,为7.1%,在单种植环境下有2个油分含量的QTL被2种算法同时检测到,分别为qOil-C2-1和qOil-M-1。另外,有2个油分含量QTL在2个以上种植环境重复检测到,为2011年哈尔滨和2011年红兴隆2个种植环境下同时检测出的qOil-A1-1,2011红兴隆、2011牡丹江和2012哈尔滨3个地点同时被检测出的qOil-B1-2。在互作效应分析中,共检测出3对蛋白质上位效应QTL和4对油分上位效应QTL,在蛋白质上位性分析中,上位效应值在0.2068-0.3124,贡献率在0.0227%-0.0265%,分布在A1、C2、D1和E连锁群上,其中,qPro-A1-3与qPro-C2-1效应值为负,其余2对效应值为正,连锁群A1,D1a均有2个QTL发生互作。在油分上位性分析中,上位效应值在0.0926-0.1682,贡献率在0.0294%-0.0754%,分布在A1、C2、I、J、N和O连锁群上,其中,qOil-C2-4与qOil-N-1效应值为负,其余3对效应值为正,在N连锁群的qOil-N-1同时与2个QTL发生互作,分别是C2连锁群上的qOil-C2-1和qOil-C2-4。在与环境互作中,qPro-D1a-3与qPro-E-1在2012年佳木斯地点没检测出,其余6对都检测出与环境的互作效应,贡献率分别为0.0001%-0.0378%,互作效应都较小,明显小于自身的加性效应。【结论】定位到9个蛋白质相关QTL和11个油分相关QTL,并发现3对蛋白质含量上位性效应QTL和4对油分含量上位性QTL。     

基于全基因组重测序的山羊产羔数性状关键调控基因的筛选

目的 对产羔数不同的山羊进行全基因组重测序分析,挖掘参与调控川中黑山羊产羔数性状关键调控基因,为解析山羊产羔数性状遗传机制及分子遗传改良提供理论依据。方法 选择6只产4—6羔的川中黑山羊为高繁组（high fecundity, HF）和6只产单羔的川中黑山羊为低繁组（low fecundity, LF）,采集颈静脉血液样本提取基因组DNA,构建350 bp双末端测序文库,利用Illumina HiSeq PE150平台对12个文库进行全基因组重测序。测序产出的净数据经BWA软件比对至山羊参考基因组ARS1,所获得的高质量SNPs通过两种全基因组扫描分析方法（Fst、Hp）的综合分析确定候选区域,候选区域的注释基因分别利用g:Profiler和KOBAS在线数据库进行GO分析与KEGG通路分析,以筛选调节川中黑山羊产羔数性状候选基因。为了进一步鉴定调节山羊产羔数目的关键遗传标记,根据基因组重测序变异分析,对繁殖候选基因的同义与非同义SNPs进行定位筛选,后续将12个山羊样本的扩增产物进行Sanger测序以验证重测序结果。结果 12只山羊共获得431.50 Gb 净数据,经变异检测与注释发现,HF组山羊共发现7 771 417个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs),LF组山羊检测到8 935 907个SNPs,且LF组各类SNPs 均多于HF组。设置同时达到top 5%最大ZFst值和top 5%最小ZHp值的窗口为候选区域,在低杂合性、高遗传分化的区域共注释130个强选择信号,其中HF组、LF组以及共享窗口的注释基因分别为84、59和13个,经GO富集与KEGG通路分析发现,19个候选基因参与川中黑山羊的繁殖、繁殖过程和胚胎发育等调控,包括11个HF组特异性候选基因（ADCY10、DRD1、HS6ST1、IGFBP7、MSX2、NOG、NPHP4、PAPPA、PRLHR、TDRP和XYLT1）,5个LF组特异性候选基因（ANXA5、IGF1、EDNRA、FANCL 和TAC1）和3个HF组与LF组共享窗口基因（AKR1B3、HDAC4和OPRM1）。同时,大多数GO分析,如G蛋白偶联受体活性、激素反应和神经肽信号通路等,都包含这19个候选基因。此外,14个HF候选基因有9个显著富集在代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素/肝素的生物合成、钙离子信号通路、cAMP信号通路和叶酸生物合成等KEGG通路中（P<0.05）。19个繁殖候选基因中共有2个同义突变（MSX2 G771T,ADCY10 A4662G）与2个非同义突变（PRLHR G529A,DRD1 A281T）,且仅定位于HF候选基因中。Sanger测序发现,MSX2、PRLHR和DRD1突变位点均可检测到多态性,与基因组重测序结果一致,其中PRLHR G529A多态性导致第177位丙氨酸突变为苏氨酸,DRD1 A281T多态性导致翻译提前终止。结论 本研究共发现11个HF组特异性候选基因,推测是川中黑山羊多羔性状的关键调控基因,PRLHR外显子G529A与DRD1外显子A281T突变可能是调控山羊多羔性状的关键遗传标记,在改良山羊繁殖性能方面具有较大的应用价值。     

基于特异性引物分子标记技术的大豆根腐病主要病原菌分子判别体系研究

[目的]探索大豆根腐病主要病原菌分子检测方法,为复合侵染病害的进一步深入研究及大豆根腐病的科学防治奠定基础.[方法]采用病原菌rDNA-ITS区段序列分析对各病原菌种进行分子验证,采用病原菌特异性引物对大豆根腐病各病原菌种进行分子标记,以特异性引物分子标记技术建立多病原的分子判别体系.[结果]通过序列比对使收集到的7种大豆根腐病致病菌(立枯丝核菌、瓜果腐霉菌、尖孢镰孢霉、禾谷镰孢霉、茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种、燕麦镰孢霉)的鉴定结果得到分子验证;采用6种针对各病原菌种的引物(茄腐镰孢霉和茄腐镰孢霉蓝色变种为同一引物)进行的扩增实验均有特异性条带;经扩增条件优化和灵敏度检测初步建立针对大豆根腐病多种病原菌的分子判别体系.[结论]采用特异性引物分子标记技术基础上的病原菌分子判别体系可用于多病原复合侵染大豆根腐病的病原菌种类的分子判别,并为该病分子检测技术的建立奠定基础.     

基于近红外光谱的大豆茎秆化学组分含量检测模型构建与应用

[目的]大豆茎秆化学组分(纤维素、半纤维素、木质素和粗纤维等)与其茎秆抗倒伏能力密切相关,但由于目前大豆茎秆化学组分检测多采用传统的化学分析技术,测定过程操作复杂、耗时耗力、成本昂贵且易造成环境污染,不适合大规模育种应用,因此,通过构建一套低成本、快速、科学、无污染的大豆茎秆化学组分检测方法,为大豆种质资源茎秆组分分布...     

A Modified Method for the Development of SSR Molecular Markers Based on Redundant EST Data and Its Application in Soybean

EST-derived SSR marker has been developed in many species,but few methods of high efficiency have been reported for the exploitation of EST-SSR markers.Thus,a high efficiency method for mining millions...     

基于新遗传连锁图谱的豇豆抗豆象QTL定位

【目的】豆象是危害豇豆最主要的仓储害虫。发掘豇豆抗豆象基因为抗性品种的选育,以及减少豆象对豇豆生产的危害奠定基础。【方法】以中豇1号(感)和Pant-lobia-1(抗)为亲本构建的包含282个株系的RIL群体为研究材料,利用人工接种法分别对282个株系接种绿豆象和四纹豆象,进行抗豆象表型鉴定,并利用两亲本对3 992个来源于绿豆、小豆和豇豆的SSR标记进行多态性筛选,然后利用筛选到的多态性标记对282个株系进行基因型分析,最后结合RIL群体各株系抗豆象表型鉴定数据和基因型分型数据,采用完备区间作图法(ICIM-ADD)进行抗豆象QTL定位分析,在此基础上构建遗传连锁图谱,并定位豇豆抗豆象基因。【结果】中豇1号和F1籽粒的被害率均为100%,Pant-lobia-1籽粒的被害率分别为22.5%和42.5%。推测Pant-lobia-1对绿豆象和四纹豆象的抗性均为隐性遗传;筛选到182个多态性标记,利用这些多态性标记构建了一个包含11个连锁群的豇豆遗传连锁图谱,图谱总长1 065.23 cM,相邻标记间平均遗传距离为5.85 cM;经2种豆象处理,分别在连锁群1和连锁群5上检测到2个稳定...     

利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记

【目的】果树的矮生性状是一种重要的农艺性状,对果树的集约化栽培具有重要意义。来自西洋梨实生变异品种‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于一个单显性基因Pc Dw,目前关于该基因的序列信息等还不清楚。本研究的目的是开发与其紧密连锁的DNA分子标记,为鉴定该基因提供依据。【方法】根据分离群体分组分析的原理,以‘矮生梨’ב茌梨’和‘2-3’ב绿宝石’2个F1杂交分离群体为试材,应用IIB型限制性内切酶的RAD技术(Restriction association site DNA,2b-RAD)对2对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序分析,在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点,从中筛查出位于Pc Dw定位染色体上的SNPs,用高分辨率熔解曲线分析技术(High-resolution melting analysis,HRM)在群体上进一步检测验证,以确定其与Pc Dw位点的连锁关系。【结果】对4个样本(即4个对比基因池)的2b-RAD标签测序文库的测序结果共产生67 186 260条reads,平均每个样本测序reads数为16 796 565。将原始reads进行质量过滤后的统计结果表明,每个样本获得平均unique标签数目为86 810,平均测序深度为77×,该测序深度能够达到准确分型的标准。SOAP软件定位结果表明,4个测序文库中含有酶切位点的高质量reads占测序原始reads的70%以上,表明测序质量较好。在来自2个不同群体的矮生型基因池与普通型基因池间进行对比分析,初步筛选出SNP位点1 317个,其中有8个位于PcDw的定位染色体scaffold00074上。用HRM技术对这8个SNP标记在群体上的进一步检测结果表明,在‘矮生梨’ב茌梨’群体上有2个SNP标记、在‘2-3’ב绿宝石’群体上有4个SNP标记表现出与Pc Dw位点共分离的特性,根据其扩增子的熔解曲线形状差异,可有效区分矮生型和普通型表型。在来自‘矮生梨’ב茌梨’群体的215个杂种后代和来自‘2-3’ב绿宝石’群体的168个杂种后代中,未发现有标记与性状的重组类型。【结论】2b-RAD测序技术与HRM分析技术相结合,进行果树重要农艺性状分子标记的开发,是一种行之有效的方法。基于这一策略,本研究鉴定获得了4个与西洋梨矮生性状单显性基因Pc Dw连锁的SNP标记。     

家蚕荧光茧色分子标记初探

为了获得家蚕荧光茧色基因的分子标记,以家蚕的荧光品种C408黄和C408紫为材料,采用400多个RAPD随机引物筛选分子标记,获得了与家蚕紫荧光茧色有关的1个分子标记CFP-01859.并通过设计特异引物转换成SCAR标记验证,证明获得的标记真实、可靠,并对该分子标记的片段进行了克隆和测序.