大豆钾转运体基因GmKT12的克隆和信息学分析

以钾高效和钾敏感型大豆品系为试验材料,设置低钾胁迫试验,在8个时间段取样提取RNA,利用Real time-PCR检测GmKT12基因的表达量,结果显示GmKT12基因在不同品系地上部和地下部表达水平有显著差异,其原因来自GmKT12基因的氨基酸序列和蛋白质结构的变异。从2个品系中分别克隆目的基因并对基因序列进行同源性及生物信息学分析表明,与GmKT12基因相似性在30%以上的同源基因有56个,GmKT12在进化树中的位置与Glyma18g18822最近;GmKT12编码蛋白为可溶性跨膜蛋白,具有多个磷酸化位点,该基因与信号转导有关,对大豆获取及转运钾离子可能起着关键作用。     

大豆中2个编码 PR10蛋白新基因的克隆与分析

从抗大豆花叶病毒病（ SMV）大豆材料科丰1号中克隆到2个编码PR10蛋白的新基因Glyma09g05430和Glyma15g15509，Glyma09g04530和Glyma15g15590基因的ORF全长均为477 bp，编码158个氨基酸。序列比对与系统发生树分析结果表明：Glyma09g04530和Glyma15g15590是大豆中2个编码PR10蛋白的新基因。 Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆的根、茎及叶中均有表达；接种大豆SMV后，Glyma09g04530和Glyma15g15590基因在大豆科丰1号的叶片中的表达均被强烈诱导并高效表达，显示Glyma09g04530和Glyma15g15590基因与大豆SMV抗性密切相关。     

大豆Glyma08g11030基因结构及原核表达分析

为了进一步明确Glyma08g11030基因的功能,利用生物信息学和PCR的方法,对Glyma08g11030进行序列分析及蛋白结构域分析。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长1 419 bp,开放阅读框长1 362 bp,编码453个氨基酸,蛋白质分子质量约为51.288 ku,等电点为8.14。序列分析表明,Glyma08g11030基因组包含2个外显子和1个内含子。多序列比对结果表明,Glyma08g11030蛋白含有1个F-BOX保守域。进化树分析表明,该蛋白与木豆、菜豆、花生、豇豆、红小豆具有同源关系。为了获得纯化的Glyma08g11030蛋白,将扩增片段克隆至原核表达载体pET28a,构建重组质粒pET28a-Glyma08g11030,经过SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白,结果表明,该蛋白主要以包涵体形式存在。为进一步纯化和鉴定Glyma08g11030蛋白及研究其功能奠定了基础。     

马铃薯可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因克隆及生物信息学分析

用RT-PCR方法从马铃薯中克隆了可溶性淀粉合成酶SSⅢ基因的cDNA片段,序列分析表明该cDNA片段全长为3 967 bp,开放阅读框为3 693 bp,编码1 230个氨基酸.核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的马铃薯SSⅢ基因(X94400)具有99%同源性,氨基酸序列同源性达98%.应用生物信息学软件对SSⅢ基因分析表明:其编码的蛋白质具有多个磷酸化位点;蛋白质二级结构预测显示,有369个氨基酸可能形成α-螺旋结构,249个氨基酸可能形成β折叠,102个氨基酸可能形成β转角,510个氨基酸可能形成无规则卷曲;通过亚细胞定位可知,它是一种含有75个氨基酸的叶绿体转运肽蛋白.     

甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因SbSEC14的克隆及低温胁迫下的表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(PITPs)广泛存在于真核生物细胞中,能够在体外膜脂质双层之间调控磷脂酰肌醇(PtdIns)或者磷脂酰胆碱(PtdCho)单体的独立转运。参与磷酸肌醇代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫、胞浆运动和细胞周期调节等多种重要的生命过程,在植物的逆境响应以及发育调节中具有重要的作用。为了研究甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因及其在低温胁迫下的表达情况。本研究以甜菜基因组数据库中一条预测的磷脂酰肌醇转运蛋白基因CRS1为模板,用基因克隆的方法得到一条全长765 bp,开放阅读框596 bp,编码198个氨基酸的甜菜SEC14基因,命名为SbSEC14。理化性质分析表明,该蛋白质为不稳定亲水蛋白;蛋白质二、三级结构分析表明,该蛋白质α-螺旋所占的比例最高,为47.47%,β-转角所占比例最低,为5.56%;蛋白质保守结构分析表明,该蛋白质有典型的SEC14结构域;蛋白质系统进化树分析表明,甜菜SbSEC14基因与菠菜、藜麦的磷脂酰肌醇运转蛋白基因亲缘关系最近;实时荧光定量结果表明,SbSEC14基因在甜菜中组成型表达,在甜菜叶中的表达量最高,在甜菜根中的表达量最低,在叶中表达量约为根中的2.5倍。甜菜幼苗4℃处理0、2、6、12、24 h,该基因在植株处理0~2 h时表达量呈上升趋势,在植株处理2~6 h时表达量呈下降趋势,在植株处理6~24 h时表达量趋于平稳状态。因此,预测该基因与甜菜抗低温胁迫相关。     

大豆过氧化物酶Ⅲ的生物信息学分析

过氧化物酶Ⅲ(ClassⅢPOD)普遍存在于植物体内一类多基因家族蛋白,它属于一类PR蛋白;广泛参与植物的多种生理生化过程,在维持植物体内过氧自由基和H2O2处于稳定水平方面发挥着重要作用。本文通过生物信息学的方法,共筛选获得164条大豆过氧化物酶Ⅲ序列。以本实验室克隆得到的Glyma02g40040.1为目的基因,对该基因及其同源蛋白的结构和功能进行了分析,并用Mega4.0软件构建其系统进化树;同时对Soy Base中的大豆过氧化物酶Ⅲ的表达数据进行分析。结果表明:Glyma02g40040.1编码324个氨基酸,等电点为9.51,不存在跨膜结构域属于外分泌蛋白;与Gm Prx50的相似性达到93.85%,二级结构以σ螺旋为主,主要在花中和根中表达;大豆Gm Prxs基因具有明显的组织特异性表达模式。上述分析为进一步阐明过氧化物酶Ⅲ基因家族在植物生长发育过程中功能及分子机制奠定重要基础。     

小麦(Triticum aestivum)蔗糖关键合成酶基因TaSPP2克隆与结构分析

磷酸蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase,SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,在参与小麦(Triticum aestivum)蔗糖代谢转运和籽粒灌浆中起重要作用。为了在基因组DNA水平上揭示小麦SPP酶基因的结构特征,预测该基因所编码蛋白特性,本研究通过克隆小麦SPP酶全长基因,利用生物信息学方法,从基因结构、理化特性、进化关系、亚细胞定位、跨膜结构和二级结构等方面对该基因进行了预测和分析。结果表明:通过克隆、测序和拼接,获得小麦磷酸蔗糖磷酸化酶基因(TaSPP2),该基因全长2865 bp,包含8个外显子区和7个内含子区,被定位在小麦D基因组上。TaSPP2与粗山羊草(Aegilops tauschii)亲缘关系最近。该基因编码的蛋白分子量为47.19 kD,等电点为6.04,含有38处磷酸化位点,不含跨膜区,属于非分泌型亲水胞内蛋白。二级结构以无规则卷曲为主(45.02%),其次是α-螺旋占和延长链,无β-转角。本研究结果将为进一步验证和解析小麦TaSPP2基因的功能提供理论依据。     

喜树中ABA转运蛋白基因CaABAT的克隆及生物信息学分析

以喜树叶片提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增喜树中的ABA转运蛋白基因CaABAT全长序列,并克隆到pGMT载体中,序列分析表明,CaABAT基因4 377 bp,编码1 458个氨基酸,等电点为7.82,分子量约为164.8 KD,且该基因与拟南芥中ABA转运蛋白基因At ABCG40氨基酸序列同源性高达73%,并将该序列提交至GenBank(No.KY882555)。该蛋白的二级结构中α-螺旋为49.45%,β-折叠为11.04%,无规则卷曲39.51%,定位细胞的质膜上。且该蛋白基因功能分类体系(Gene ontology)分析显示其具有ATPase依赖的跨膜转运活性,可能参与细胞内如含氮化合物代谢过程。然后分别分段导入至酵母表达载体pDRGAL与植物表达载体pBIGD中,构建重组质粒pDRGAL-CaABAT和pBIGD-CaABAT。最终为探究CaABAT转运ABA功能以及研究其对植物次生代谢调控奠定基础。     

大豆ZF-HD转录因子GmZHD1的克隆及表达分析

为了揭示大豆ZF-HD基因的生物学功能,通过PCR的方法,从大豆栽培豆科丰1号中克隆了ZF-HD转录因子Glyma.02g040100,命名为GmZHD1。生物信息学分析表明,该基因的c DNA全长为888 bp,编码295个氨基酸,GmZHD1蛋白分子量约为32.64 k Da,等电点为7.69;序列分析表明,GmZHD1含有ZF-HD家族保守的锌指结构域和同源异形盒结构域,GmZHD1与Ft HB2蛋白序列一致性最高,为44.4%;亚细胞定位结果显示GmZHD1定位于细胞核;荧光定量PCR结果表明,GmZHD1在大豆不同组织中都有表达,其中,花、种子和叶片中表达较高。此外,将GmZHD1基因连接到植物过表达载体p BA002上,为进一步研究大豆GmZHD1基因的功能奠定了基础。     

大豆KCS基因的克隆及结构预测

以大豆叶片总RNA为模板,利用RT-PCR方法,克隆获得大豆KCS基因序列。采用生物信息学方法对其进行预测分析,结果表明:大豆KCS基因的CDS序列长度为1533bp,编码510个氨基酸;大豆KCS基因编码的蛋白质理论分子量为57.1kD,等电点为9.03;该基因编码的蛋白具有两个完全跨膜结构;没有信号肽;其蛋白质二级结构中α螺旋占47.65%,无规则卷曲占35.88%,β折叠占16.47%;在进化关系上,与油茶、菟葵、苜蓿的亲缘关系相对较近,该研究结果可为大豆KCS基因结构和功能的进一步研究提供理论参考。     

栽培大豆和野生大豆的Glyma13g21630基因多样性分析

利用Sanger方法对49份野生大豆,46份地方品种和38份选育品种的Glyma13g21630基因测序,采用DNAStar、Mega、DNAsp和Tassel软件分析Glyma13g21630的单核苷酸多态性(SNP)位点在不同类型大豆群体的分布规律。结果表明,在133份供试种质中检测到多态性位点29个,包括22个SNP和7个InDel,多态性频率分别为1SNP/138 bp和1InDel/434 bp。Glyma13g21630基因序列中多态性位点的分布不均匀,其中内含子3和5为变异富集区,其他区域变异较小。单倍型分析表明,Glyma13g21630在野生大豆和栽培大豆中的多态性位点数目逐渐减少,分布范围也越来越窄;连锁不平衡分析表明,野生大豆的7个高频SNP位点中有42.86%处于极显著的连锁不平衡状态;Ka/Ks>1,说明野生大豆在向栽培大豆的进化中,某些位点受到正向选择,多态性显著降低。Glyma13g21630基因在大豆由野生向栽培驯化的过程中因正向选择作用而固定了有益变异,表现出瓶颈效应。     

川西獐牙菜SmGES基因的克隆、生物信息学分析与原核表达

研究藏药川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径中的关键酶香叶醇合成酶的功能,并探讨其在香叶醇、龙胆苦苷和獐牙菜苦苷生物合成中的作用。以川西獐牙菜叶片为材料,提取RNA并反转为cDNA,通过川西獐牙菜转录组相关信息,用RT-PCR技术克隆得到了川西獐牙菜香叶醇合成酶基因,并命名为SmGES基因。将SmGES基因片段通过分子生物学的方法连接到原核表达载体pET-28a上并转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)原核表达感受态中,进行相关的诱导表达。通过生物信息学进行相关分析得出,SmGES基因长1761 bp,编码586个氨基酸;SmGES蛋白等电点为5.35,相对分子质量为67.78 kDa。分析表明SmGES基因带有叶绿体转运肽,预测其是定位于叶绿体的亲水蛋白。文章还分析了该蛋白的细胞内定位、结构域、二级和三级结构。进化关系分析表明,SmGES基因与滇龙胆的GES基因具有较近的亲缘关系。诱导得到重组蛋白分子质量67.78 kDa的蛋白条带,与预期大小一致。研究结果为进一步阐明川西獐牙菜中环烯醚萜合成途径提供参考。     

大豆GmHKT6;2基因的克隆与表达特性分析

为探明大豆中HKT蛋白基因的耐盐作用机理,从耐盐大豆材料中克隆到GmHKT6;2基因完整的cDNA序列,GmHKT6;2基因的开放阅读框(ORF)全长1 644 bp,编码547个氨基酸。序列比对与进化树分析表明:GmHKT6;2是大豆中的一个新HKT蛋白基因;GmHKT6;2基因在大豆的根、茎及叶中均能表达,150 mmol/L NaCl处理后,该基因在大豆根、茎及叶中的表达被强烈诱导并高效表达。结构域分析结果表明:大豆GmHKT6;2基因拥有10个可能的跨膜结构域(TMD)和阳离子转运蛋白保守结构域,推测其是通过调节相关阳离子的转运来调控大豆的耐盐性。     

苦瓜(Momordica charantiaL.)McGS1基因的克隆及结构预测

本研究以热研3号苦瓜总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得苦瓜谷氨酰胺合成酶基因,并命名为McGS1。生物信息学分析表明:苦瓜McGS1基因全长1 302 bp,其中CDS序列长度为1 071 bp,编码356个氨基酸;蛋白分子量为39.14 kD,等电点(pI)为5.49,元素组成为:C1751H2685N479O525S9,N末端主要为疏水性的氨基酸,而C端亲水性氨基酸较多;利用软件进行预测发现该蛋白没有跨膜区,说明它不是一个跨膜蛋白,同时发现该蛋白不存在信号肽;其蛋白质二级结构中,α-螺旋占28.37%,延伸链占17.42%,β-折叠占5.34%,无规则卷曲占48.88%;同源性比对发现苦瓜McGS1蛋白与甜瓜和黄瓜中的GS1蛋白亲缘关系最近,相似度分别达到了94.66%和95.22%。本研究结果可为进一步研究谷氨酰胺合成酶基因在苦瓜氮代谢中的调控作用提供理论参考。     

大豆响应耐涝的MAPK信号通路相关基因及蛋白的鉴定分析

大豆是一种耐涝性较差的作物,涝害会引起大豆产量下降,甚至绝产,而大豆耐涝的遗传机制尚不明确。本研究通过转录组和蛋白组的关联分析,筛选出3个大豆响应耐涝的MAPK信号通路相关的差异表达基因/蛋白,转录组数据分析结果显示,Glyma.05G124000在4个时间点的表达量变化最为明显,对其进行RT-qPCR分析,验证了转录组数据的可靠性。进而对Glyma.05G124000的理化性质和保守结构域进行分析,发现组成该蛋白的氨基酸中亮氨酸(Leu)所占的比例最高,该蛋白内部含有多个LRR保守结构域,蛋白的三级结构展示了LRR保守结构域中所有Leu的位置。本研究筛选到的3个基因都参与编码FLS2蛋白,信号肽预测结果发现Glyma.05G124000含有信号肽,根据MAPK信号通路图,我们推测涝害胁迫引发了植物类似于病原菌侵染的基本防御反应,传递信号通过FLS2蛋白进一步激活了MAPK信号通路来抵御涝害胁迫。本研究为探索大豆的耐涝机制,提高涝害条件下大豆的产量提供了理论基础和基因资源。     

玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT3J的克隆及生物信息学分析

植物蔗糖转运蛋白是植物中特有的一类跨膜蛋白,负责蔗糖经韧皮部从源到库的运输以及库组织的蔗糖供给。为了解析单子叶特异的玉米蔗糖转运蛋白基因ZmSUT3的生物学功能,本研究利用RT-PCR方法,从玉米自交系‘吉853’的基因组中克隆得到蔗糖转运蛋白ZmSUT3基因,命名为ZmSUT3J。测序结果表明:开放阅读框(ORF)长度为1 527 bp,编码508个氨基酸的蛋白质即ZmSUT3,分子量为53.51 kD。利用生物信息学的方法分析ZmSUT3蛋白属于疏水的MFS蛋白超家族,含有多个磷酸化位点,主要定位在质膜和叶绿体类囊体膜上,具有12个弯曲交叉的螺旋结构,属于跨膜蛋白。系统进化树分析表明,ZmSUT3蛋白属于SUT3亚族,与高粱的Sb SUT3亲缘关系较近。启动子区域生物信息学分析结果显示,含有多个组织特异性调控元件,还有激素调节及胁迫诱导相关顺式作用元件,推测ZmSUT3在库组织中发挥作用,参与激素相关胁迫应答反应。为验证ZmSUT3J基因的生物学功能,本研究构建了植物表达载体,为研究ZmSUT3在玉米中的功能奠定了基础。     

菜用大豆蔗糖合酶基因鉴定及表达模式分析

蔗糖含量是影响菜用大豆甜味的主要因素。蔗糖合酶(sucrose synthase, SUS)是调控蔗糖代谢的关键酶之一,在作物品质调控等方面发挥重要作用。为了深入了解菜用大豆蔗糖代谢相关GmSUSs基因的分子作用机制,本研究从基因组水平对GmSUSs进行了基因成员鉴定、蛋白理化特性、保守结构域、进化关系、基因结构、启动子元件组成、组织表达模式及激素和胁迫表达谱分析。结果表明:从全基因组水平共鉴定到11个GmSUSs编码蔗糖合酶。蛋白多序列比对显示所有GmSUSs均含有保守的特征结构域:Sucrose_synth和Glycos_transf_1。进化分析显示GmSUSs主要划分为3个分支。组织表达分析显示不同GmSUSs基因在不同生长发育阶段的表达量具有明显差异。启动子顺式作用元件分析显示GmSUSs基因上游启动子区内激素和胁迫应答元件组成各异。进一步,qRT-PCR分析显示激素(ABA, ACC和NAA)和胁迫(低温,高温和干旱)处理诱导GmSUS11基因表达。以上实验结果为菜用大豆GmSUSs基因功能解析及蔗糖代谢途径改造提供了参考。     

甘蓝型油菜BnACP5基因克隆及表达分析

ACP5基因是参与植物体中脂肪酸代谢的重要基因之一,在甘蓝型油菜中该基因还未被深入研究。为了弄清楚BnACP5基因在甘蓝型油菜中的螺旋结构及功能,以湘油15为试材,采用同源克隆法得到一个与脂肪酸合成相关的基因BnACP5。BnACP5基因CDs序列长417 bp,共编码138个氨基酸。生物信息分析表明,BnACP5蛋白的相对分子质量15.25 ku,理论等电点(p I)为5.94,其不稳定参数为43.03,属于不稳定蛋白;其总疏水平均系数(GRAVY)为-0.148,是一种亲水性蛋白;不含跨膜结构,也不含信号肽序列;二级结构中含有59.42%的α螺旋、23.19%无规则卷曲、14.49%延伸链和2.90%β转角;其中18个可能是磷酸化位点;该蛋白位被定位在线粒体内;ACP氨基酸序列比对表明,植物ACP磷酸泛酰巯基乙胺结合位点周围的氨基酸序列高度保守;UPGMA聚类分析表明,BnACP5与白菜型油菜(XP_009111933.1)亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,BnACP5基因的表达量在甘蓝型油菜种子发育的不同阶段呈一定规律变化,在授粉后15 d达到峰值,20 d呈下降趋势,25~35 d呈上升趋势,此后迅速下降,45 d表达量降到最低水平。由此分析得出,该基因可能与种子脂肪酸的合成有关。     

宁夏枸杞雄性不育基因ms2的克隆及表达分析

本研究以宁夏枸杞为材料,根据GenBank上已经登录的该基因的保守区设计简并引物,通过RTPCR扩增获得基因保守片段,利用RACE技术获得该基因3'端序列。最终,经拼接后得到一个长约1 802 bp的ms2基因片段(登录号为JQ341412.1),终止密码子为TAG,3'端包含非编码区和Poly A尾巴。相应编码基因片段527个氨基酸的肽段。生物信息学分析表明,ms2基因序列中含有NAD(P)H区域,该区域含有显著的TGXXGXXG结构单元,以及微体结合信号区域。从第44个氨基酸到第346个氨基酸为NAD结合区,从第459个氨基酸到第517个氨基酸为雄性不育C-末端区。同源性检索表明,ms2基因片段氨基酸序列与亚麻、葡萄、大豆、拟南芥和青菜的同源性分别为71%、71%、72%、65%和66%。系统进化树分析表明,宁夏枸杞ms2基因与葡萄的亲缘关系最近,与毛果杨、亚麻以及十字花科的植物聚为一类,而与江南卷柏的亲缘关系最远。RT-PCR分析表明,ms2基因在可育花蕾的2、3时期表达非常强,而在不育花蕾的2、3时期表达较弱。     

紫花苜蓿G6PDH基因的克隆与超表达载体构建

为了研究G6PDH在紫花苜蓿抗低温胁迫中的作用,以‘青大1号’紫花苜蓿为材料,利用基因克隆、RACE技术获取‘青大1号’紫花苜蓿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因,并进行生物学信息分析和超表达载体的构建。结果显示,成功克隆了一个紫花苜蓿G6PDH基因,该基因c DNA全长2 260 bp,含有1个长度为1 752 bp的开放阅读框,编码583个氨基酸。MsG6PDH与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆等序列一致性达到88%以上;在进化上,Ms G6PDH与同为豆科植物的绿豆、野大豆、大豆亲缘关系最近。经预测,Ms G6PDH蛋白二级结构中,α-螺旋占37.91%,β-折叠占5.66%,无规则卷曲占40.31%,并预测得到其三级结构。分析MsG6PDH编码的氨基酸序列得知,Ms G6PDH蛋白分子量为65.71 k D;理论等电点为8.25;不稳定系数为44.54,为不稳定蛋白,并且属于亲水性蛋白。此外,还同时成功构建了该基因的植物超表达载体pPZPY112-MsG6PDH。本研究将为明确G6PDH在紫花苜蓿响应低温的信号转导途径中的作用提供理论依据。