基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。     

Bt杀虫蛋白在亚洲玉米螟幼虫体内组织中的分布

采用ELISA法检测了亚洲玉米螟取食转基因玉米后,Bt杀虫蛋白(Cry1Ab杀虫蛋白)在幼虫体内组织中的分布情况.结果表明,中肠和血淋巴中Bt杀虫蛋白含量最高,分别为267 ng·g-1和417 ng·g-1,丝腺、脂肪体、马氏管的含量较低,生殖器官中未检测到Bt杀虫蛋白;幼虫取食转基因玉米3d后改喂普通玉米的亚洲玉米螟发育成的蛹、成虫及卵中不含Bt杀虫蛋白.     

Cry1Ac抗、感棉铃虫碱性磷酸酯酶（ALP1）的表达量比较

【目的】通过比较Cry1Ac抗、感棉铃虫昆虫中肠碱性磷酸酶（ALP1）表达量的差异及抗性棉铃虫取食Cry1Ac蛋白对ALP1表达量的影响,分析ALP1表达量变化与抗性的关系,为进一步明确Bt抗性机制、制定抗性治理策略提供理论依据。【方法】利用实时荧光定量PCR技术,比较敏感棉铃虫、Cry1Ac抗性棉铃虫取食含Cry1Ac蛋白的饲料和正常饲料后ALP1表达量的差异。【结果】ALP1在棉铃虫整个发育期都表达,幼虫的表达量最高,蛹期表达量最低,在成虫体内也有较高的表达;ALP1在幼虫中肠表达量最高,其次是后肠、前肠、马氏管,表皮中的表达量最低;与敏感品系相比,对Cry1Ac具有中等水平抗性的棉铃虫ALP1表达量明显增加,尤其是取食含Cry1Ac蛋白饲料的抗性棉铃虫幼虫的ALP1的表达量显著升高,但抗性棉铃虫取食正常饲料后,2、3龄幼虫的ALP1的表达量与敏感棉铃虫差异不显著;所有的抗性品系4龄棉铃虫幼虫中肠ALP1的表达量都显著高于敏感品系,而且随着棉铃虫抗性倍数的升高,ALP1的表达量呈逐渐降低的趋势。【结论】抗性棉铃虫中肠ALP1表达量的改变可能与Cry1Ac抗性、Cry1Ac代谢有一定的关系。     

人工饲料对大草蛉生长发育和繁殖力的影响

【目的】研究应用米蛾卵和以黄粉虫蛋白为主要成分的人工饲料对大草蛉的饲养效果。【方法】用米蛾卵饲喂大草蛉幼虫,用基于黄粉虫蛋白的人工饲料饲养成虫,记录相关生物学参数,以米蛾卵和大豆蚜分别饲喂大草蛉幼虫至成虫为对照。【结果】米蛾卵饲喂大草蛉效果良好,茧的大小、成虫体长、结茧率、羽化率、成虫获得率、卵孵化率、成虫寿命和总产卵量均和对照无显著差异,但幼虫发育历期、茧的发育历期和产卵前期延长,发育整齐度稍下降。以人工饲料饲养的大草蛉成虫寿命、成虫产卵前期和产卵天数明显延长,卵孵化率明显上升。但是成虫存活率,雌虫产卵率显著下降,总产卵量略有降低。【结论】米蛾卵可以作为实验室繁殖大草蛉的人工饲料,以黄粉虫为主要成分的大草蛉成虫人工饲料具有开发价值。     

诱集植物香根草对二化螟幼虫致死的作用机制

【目的】香根草(Vetiveria zizanioides)能够有效诱集水稻害虫二化螟(Chilo suppressalis)雌成虫在其上产卵,但孵化出的幼虫在香根草上不能完成生活史。本研究旨在明确香根草对二化螟幼虫致死的作用机制,为开发以香根草为基础的水稻螟虫可持续控制新技术提供理论依据。【方法】通过有机溶剂萃取和硅胶柱层析方法提取香根草有毒活性物质,并利用饲料混毒法测定各提取组分对二化螟3龄幼虫的生物活性,同时利用生物化学方法测定水稻和香根草中营养物质含量以及二化螟3龄幼虫取食水稻和香根草后体内相关解毒酶和消化酶的活性变化。【结果】香根草石油醚萃取物处理二化螟3龄幼虫9、12、15 d后,死亡率分别为38.89%、57.41%、85.19%,显著高于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物等其他提取组分处理二化螟幼虫后的死亡率。进一步从香根草石油醚萃取物中分离获得组分1(Fr1)和组分5(Fr5),对二化螟3龄幼虫的具有较高毒性,以0.05 g·mL~(-1)浓度混入人工饲料饲喂3 d后死亡率分别为85.00%和67.67%,说明香根草中含有对二化螟幼虫具有致死作用的有毒活性物质。香根草中总蛋白、纤维素、总糖、氨基酸等营养物质含量分别为9.45μg、1.61%、1.45%、4.00%,均显著低于水稻中相应营养物质含量,其中水稻中蛋氨酸含量是香根草中的7.0倍。而香根草中单宁含量则显著高于水稻中的含量,是水稻中的1.31倍。此外,二化螟取食水稻和香根草3 d后,取食香根草的3龄幼虫体内蛋白酶、淀粉酶、海藻糖酶和蔗糖酶等消化酶的活性显著低于取食水稻幼虫体内相应消化酶的活性;6 d后,取食香根草的3龄幼虫体内细胞色素P450酶活性显著低于取食水稻的幼虫;9 d后,取食香根草的3龄幼虫体内羧酸酯酶CarE的活性显著低于取食水稻的幼虫。与取食水稻的3龄幼虫相比,取食香根草的幼虫体内谷胱甘肽硫转移酶GSTs的活性也有所降低,但是两者在统计学上没有显著差异。【结论】香根草作为二化螟的致死型诱集植物,对二化螟幼虫的致死作用主要表现在两方面:一是香根草中含有对二化螟幼虫具有致死作用的有毒活性物质,这些物质通过抑制幼虫体内解毒酶CarE和P450酶的活性,使幼虫逐渐丧失解毒代谢能力,最终死亡;二是香根草相对水稻营养物质匮乏,二化螟幼虫取食香根草后营养不均衡,从而影响体内消化酶活性,造成消化功能紊乱,影响其正常生理活动,最终死亡。     

大草蛉幼虫对烟粉虱的捕食功能反应及捕食行为观察

 【目的】评估大草蛉(Chrysopa pallens)对烟粉虱(Bemisia tabaci)卵、若虫及伪蛹的搜寻、控害潜能,观察分析其捕食行为。【方法】在室内设置不同密度的烟粉虱卵、若虫及成虫供大草蛉高龄幼虫取食,统计大草蛉3龄幼虫在不同猎物密度下的净取食和取食比例,并进行相关统计分析。观察大草蛉3龄幼虫的取食行为的若干独立行为事件,系统描述其行为事件内容,分析研究各行为发生频次及持续时间占总捕食过程的比例。【结果】大草蛉3龄幼虫对烟粉虱卵、若虫及伪蛹的捕食功能反应均同时拟合Holling II及III型方程。在室内条件下,大草蛉3龄幼虫的捕食量随猎物密度的增加而上升,其瞬间攻击率随烟粉虱虫龄的增加而增大,且处理时间为若虫＞伪蛹＞卵,最佳寻找密度为若虫最低。对搜寻效应的估计结果表明,大草蛉幼虫对烟粉虱的搜寻效应随烟粉虱虫龄的增加而升高。大草蛉取食卵及若虫时,其行走及搜索行为所占比例相当,而取食伪蛹时搜索行为所占比例最高而取食其次。同时,在捕食过程中,各行为事件的发生比例也存在显著差异。【结论】大草蛉高龄幼虫在低密度下对烟粉虱卵、若虫及成虫的捕食能力随密度增长且不受密度制约,其捕食行为事件的发生频次及持续时间在取食不同类型猎物时差异显著。     

Bt杀虫蛋白对甜菜夜蛾生长发育的影响

 实验室内研究了Bt杀虫蛋白对甜菜夜蛾生长发育的影响。结果表明：甜菜夜蛾二龄幼虫取食含Bt杀虫蛋白浓度为0.5μg/g,1.0μg/g,2.0μg/g,4.0μg/g,8.0μg/g的人工饲料后,随着饲料中杀虫蛋白浓度增加,幼虫死亡率增加、幼虫发育历期延长、蛹的发育历期缩短、蛹重变轻、化蛹率降低。甜菜夜蛾四龄幼虫取食含Bt杀虫蛋白浓度为2.0μg/g,4.0μg/g,8.0μg/g,16.0μg/g的人工饲料后,幼虫死亡率、化蛹率、蛹的羽化率均无明显差异;而幼虫发育历期延长、蛹的发育历期缩短,蛹重减轻。杀虫蛋白浓度为8.0μg/g,16.0μg/g时,幼虫发育历期明显长于对照。杀虫蛋白浓度为16.0μg/g时, 蛹的发育历期和蛹重与对照差异显著     

抗性选育对小菜蛾体内解毒酶和消化酶活性的影响

测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系(Cry1Ac–R)、Cry1Ac敏感品系(Cry1Ac–S)3种解毒酶的活性。结果表明,小菜蛾抗性品系的谷胱甘肽转移酶活性高于敏感品系;敏感品系的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性高于抗性品系,但2品系的解毒酶活性无显著差异。测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系、敏感品系及Bt抗性品系(Bt–T2)消化酶活性,结果小菜蛾敏感品系海藻糖酶、蔗糖酶活性均最高,Bt抗性品系最低,但各品系的2种消化酶活性之间差异不显著;小菜蛾敏感品系蛋白酶活性最高,抗性品系最低,各品系的蛋白酶活性差异极显著。     

5种饲料对洋虫生长发育的影响

常温条件下,采用大米粉、大豆粉、面粉、爆米花、中草药5种饲料饲喂洋虫,观察了洋虫的卵、幼虫、蛹、成虫的形态特征、取食习惯、活跃程度等生活习性,分析了5种饲料饲喂的洋虫幼虫化蛹后,饲料种类对蛹的发育历期、蛹重、成虫的体重等生理指标的影响,结果表明：5种饲料中蛹发育历期最长的为大豆粉饲料,发育历期最短的为大米粉饲料;用面粉和大米粉饲喂的幼虫化蛹后蛹最重;5种饲料下成虫体重由重到轻的顺序依次为：中草药＞爆米花＞面粉＞大米粉＞大豆粉。综合经济成本考虑,建议以爆米花为主要饲料,并混合适当的大米粉饲喂洋虫效果最佳。     

转Cry抗虫基因玉米对家蚕的安全性评价

家蚕可能通过取食漂移到桑叶上的玉米花粉从而受到转基因玉米中表达的Cry蛋白的影响。实验采用室内生物测试的方法评价了转cry1Ab和cry2Ab基因玉米GAB-3花粉对家蚕可能产生的影响,并采用在饲料中掺入蛋白的方式检测了转基因玉米中广泛使用的6种Cry杀虫蛋白对家蚕的毒性。当桑叶上GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,对家蚕幼虫存活率无显著影响,达500粒·cm^-2时,家蚕14 d存活率为0;以10粒·cm^-2的GAB-3花粉饲喂家蚕幼虫7 d对其体重无显著不利影响,但延长饲喂时间或者当GAB-3花粉密度为50粒·cm^-2时,家蚕的体重显著低于对照组;转基因和非转基因玉米花粉处理14 d或更长时间的家蚕体重均低于无花粉处理组。与非转基因对照处理组相比,低于100粒·cm^-2的转基因玉米GAB-3花粉处理组家蚕的化蛹率、茧重、茧壳重和蛹重无显著差异,转基因玉米和非转基因玉米花粉处理均会延长家蚕幼虫的发育历期。GAB-3花粉对家蚕7 d的LC₅₀为261.18粒·cm^-2,随着处理时间延长,LC₅₀下降。测试的6种Bt杀虫蛋白对家蚕的毒性依次为Cry1C>Cry1Fa>Cry1B>Cry2A>Cry1Ab>Cry1Ac。目前,在中国接近商业化的转基因玉米中多采用的Bt杀虫蛋白为Cry1Ab和Cry2A,二者对家蚕的毒性较低,并且在实际生产中,家蚕接触到的转基因玉米花粉密度较低,因此转Cry抗虫基因玉米对家蚕的风险较低。     

稻纵卷叶螟颗粒体病毒的持续感染及检测

【目的】稻纵卷叶螟颗粒体病毒（Cnaphalocrocis medinalis granulovirus,CnmeGV）是稻纵卷叶螟的专性病原微生物,病毒持续感染对害虫种群控制具有重要作用。研究旨在建立CnmeGV持续感染的检测方法,分析病毒持续感染对害虫种群的控制作用,为病毒杀虫剂的应用提供理论依据。【方法】多重比较分析颗粒体病毒granulin基因序列,选择变异较大区域设计CnmeGV巢式PCR引物并评估探针的灵敏度和可靠性。室内使用玉米苗繁殖稻纵卷叶螟,以10⁶ OB/mL的亚致死浓度口服感染4龄幼虫,并饲养至成虫阶段,统计羽化率。以10%甲醛处理口服感染病毒的昆虫体表,利用探针分析稻纵卷叶螟持续感染种群中幼虫、蛹、蛹蜕及成虫的带毒率。施用10⁶ OB/mL病毒制剂,监测次年稻纵卷叶螟幼虫发病率,并检测田间土壤的带毒率。【结果】建立了CnmeGV的巢式PCR探针,包括外侧引物Cm-gran1和内侧引物Cm-gran2。巢式PCR探针检测最低灵敏度为0.85 fg·μL^-1,是常规PCR的1 000倍。探针具有较高的可靠性,在稻纵卷叶螟的食物源（水稻、玉米）、其他多角体和颗粒体病毒中,均未检测到目标片段。使用10%甲醛处理病毒感染的幼虫体表10、30 min和16 h后,均未检测到病毒目标片段,但处理16 h后,稻纵卷叶螟蛹不能羽化。亚致死浓度的病毒处理稻纵卷叶螟幼虫96 h后,未显症幼虫经体表处理后病毒检出率为100%。待幼虫化蛹及羽化后,蛹、蛹蜕和成虫的病毒检出率分别为87.5%、83.3%和16.7%。经卡方检测,幼虫到化蛹阶段,病毒感染率未有显著变化（χ²=3.2,P=0.234）;而蛹羽化为成虫,病毒检出率显著降低（χ²=32.356,P=0）,表明成虫在变态过程中,大部分病毒随蛹蜕一起被排出体外。进一步待蛹羽化,发现和对照群体93.4%的羽化率相比,病毒感染群体成虫羽化率仅有30.8%。田间调查显示,已使用CnmeGV的田块次年稻纵卷叶螟幼虫病毒显症率为4%,土壤带毒率为58%,病毒可以在土壤中存活并通过水平传播持续感染稻纵卷叶螟种群。【结论】构建的巢式PCR探针具有较高的灵敏度,可用于CnmeGV持续感染的检测。CnmeGV的持续感染可有效控制稻纵卷叶螟的发生,成虫变态在稻纵卷叶螟体内病原物的清除中发挥了重要作用。     

枣实蝇对不同发育期骏枣和酸枣果实的生物学响应变化

【目的】研究枣实蝇在寄主植物果实不同发育期的危害程度对其最佳防治期。【方法】分析枣园对不同寄主枣树样枝套袋枣实蝇的蛀果率,调查虫口密度;室内饲养测定果实不同发育期对枣实蝇生长发育和繁殖的影响,分析和评价枣实蝇对不同发育期骏枣和酸枣果实的生物学响应变化。【结果】枣实蝇对骏枣果实的蛀果率均大于对酸枣的蛀果率,并且枣实蝇在骏枣果实成熟期蛀果率为最大;成熟期骏枣上的虫口密度也最大;骏枣上雌虫产卵痕数、幼虫数和卵的孵化率均大于酸枣上的枣实蝇。在枣果着色期和成熟期,蛹的各项生长指标均高于膨大期;果实不同发育期,骏枣上的蛹各项生长指标均显著大于(P<0.05)酸枣上的;骏枣上枣实蝇的蛹期、雌虫怀卵量、性成熟历期、交配时间以及雌雄成虫寿命均略大于酸枣,但无显著差异(P>0.05)。【结论】枣实蝇对骏枣的选择性强于酸枣,并且成熟期的骏枣果实更适宜枣实蝇生长发育。     

甜菜夜蛾双重氧化酶基因SeDuox的克隆、表达及功能分析

【目的】昆虫双重氧化酶（dual oxidase,Duox）介导产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）是调节昆虫肠道微生物动态平衡的重要免疫机制。本研究通过分析甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）双重氧化酶基因（SeDuox）的序列特征与表达模式,RNAi技术探究SeDuox基因沉默对甜菜夜蛾肠道细菌载量的影响,分析SeDuox对苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）的免疫响应,从而明确SeDuox在昆虫肠道免疫调控中的作用,为甜菜夜蛾的综合防控提供新的思路和作用靶标。【方法】利用反转录PCR（RT-PCR）技术克隆SeDuox,序列特征进行生物信息学分析,采用ClustalX和MEGA_X软件构建系统发育树;克隆SeDuox膜外91—1 767 bp编码基因SeDuox-OM,利用Bac to Bac表达系统构建Bacmid-SeDuox-OM,脂质体转染法转染昆虫细胞Sf9,表达SeDuox-OM膜外蛋白;采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法分析甜菜夜蛾不同组织（围食膜、血淋巴、脂肪体、马氏管、中肠和表皮）和不同发育时期（卵、1—5龄幼虫、雌蛹、雄蛹）SeDuox的表达水平;利用RNAi技术进行功能分析,向4龄幼虫注射SeDuox的dsRNA,以注射绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的dsRNA作为对照,注射48 h和72 h后检测基因沉默效果及肠道细菌载量的变化;向甜菜夜蛾幼虫饲喂Bt,RT-qPCR方法分析SeDuox及相关免疫基因的诱导表达情况。【结果】SeDuox序列全长为4 497 bp,编码1 498个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量为171.62 kD。SMART分析结构域发现SeDuox含有过氧化物酶结构域（peroxidase）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结构域（NAD）、N-端钙离子结合域（EFH）、铁还原酶结构域（Ferric）和黄素腺嘌呤二核苷酸结构域（FAD）,与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）、草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等昆虫的Duox结构域类似。TMHMM分析显示有7个跨膜区,跨膜片段SeDuox-OM 在昆虫细胞中成功表达约80 kD的重组蛋白;RT-qPCR分析结果显示SeDuox在甜菜夜蛾4龄幼虫不同组织中均有表达,其中围食膜和中肠表达量较高;在不同发育时期均有表达,但在卵期表达量最高。与注射dsGFP相比,注射 dsSeDuox 的甜菜夜蛾幼虫在48 h和72 h时,SeDuox表达量分别下调了62.08%和74.94%,肠道微生物载量显著升高。甜菜夜蛾幼虫取食Bt GS36 48 h时,SeDuox表达量显著增加,随着侵染时间的延长,其表达量呈现出先升高后降低再趋于稳定的特点。【结论】甜菜夜蛾SeDuox具有保守的结构域,在中肠和围食膜中高表达,SeDuox在宿主肠道免疫调控中起重要作用,可能与抗菌肽基因协同作用抵御Bt的侵染。     

旋幽夜蛾对寄主植物选择偏好和种群适合度

【目的】研究旋幽夜蛾对寄主植物的选择偏好和种群适合度,为旋幽夜蛾的生态防治提供理论依据。【方法】通过田间罩笼试验和室内饲养试验,调查产卵选择率、幼虫取食选择率、生长发育指标和种群参数。【结果】旋幽夜蛾成虫产卵选择率为灰藜＞棉花＞甜菜＞白菜,幼虫取食选择性由高到低依次为甜菜＞白菜＞灰藜＞棉花。参试4种寄主植物的幼虫历期由长到短为棉花＞甜菜＞白菜＞灰藜,蛹历期为棉花＞甜菜＞灰藜＞白菜。饲喂白菜、棉花比饲喂灰藜、甜菜的蛹质量稍重。饲喂4种寄主植物的孵化率为81.97%～87.26%,饲喂灰藜的幼虫存活率最高,为82.93%,饲喂棉花的幼虫存活率最低,为22.50%,饲喂棉花的蛹存活率最高,为100.00%,饲喂甜菜的蛹存活率最低,为82.36%,饲喂灰藜的羽化率最高,为91.36%,饲喂甜菜的羽化率最低,为71.38%。饲喂白菜的产卵量最高,为367.30粒/雌,饲喂棉花的产卵量最低,为274.70粒/雌。【结论】棉花、白菜、甜菜、灰藜均可作为旋幽夜蛾的寄主。灰藜、白菜、甜菜均为旋幽夜蛾的适宜寄主。灰藜是旋幽夜蛾最偏好选择产卵的寄主,甜菜、白菜是幼虫最偏好取食的寄主,旋幽夜蛾对寄主的产卵选择偏好与取食选择偏好存在差异。参试4种寄主饲喂旋幽夜蛾,各寄主间对卵历期、成虫历期和繁殖力、卵孵化率无显著影响,但对其幼虫历期、蛹历期、世代历期、幼虫存活率、蛹存活率、羽化率、蛹重存在显著影响,旋幽夜蛾对参试4种寄主植物的适合度存在一定差异。     

棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry1Ac毒力的影响

【目的】 研究棉铃虫（Helicoverpa armigera）中肠蛋白ABCC1（HaABCC1）与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】 分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系（96S）和Cry1Ac抗性品系（BtR）棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】 HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系（BtR）与敏感品系（96S）棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】 HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。     

莲草直胸跳甲Halloween基因家族鉴定及表达分析

【背景】 莲草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）是世界恶性入侵杂草空心莲子草（Alternanthera philoxeroides）的专一性生防天敌;莲草直胸跳甲种群动态呈季节性波动趋势,在我国湖南地区其夏季种群数量骤减,导致对空心莲子草的防控效果大大降低。而Halloween基因家族参与昆虫蜕皮激素的合成,影响昆虫生长和繁殖,进而对昆虫种群动态具有一定影响。【目的】 揭示Halloween基因家族在莲草直胸跳甲不同发育时期和不同组织中的表达模式,为进一步探究Halloween基因家族在莲草直胸跳甲中的功能打下基础,进而为生防天敌的扩繁提供新思路。【方法】 通过筛选莲草直胸跳甲卵巢转录组数据并结合生物信息学分析,找到并克隆其体内Halloween基因家族成员;使用NCBI在线分析其保守结构域,利用MEGA6.0对Halloween家族基因进行多序列比对并构建系统发育树;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测各基因在莲草直胸跳甲不同发育时期（卵、幼虫、蛹、雌成虫）和雌成虫不同组织（头、胸、中肠、卵巢、脂肪体）中的表达水平。【结果】 莲草直胸跳甲中存在6个Halloween基因家族成员,分别为AhCYP302A1、AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2、AhCYP314A1和AhCYP315A1;分析发现其均属于P450超家族且具有一定保守性,其中AhCYP306A1、AhCYP307A1、AhCYP307A2聚为一支,属于P450超家族中CYP2集团,AhCYP302A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1聚为一支,属于线粒体集团;同时,AhCYP306A1、AhCYP314A1、AhCYP315A1在5′端存在跨膜区域。6个Halloween基因在莲草直胸跳甲整个生活史及各个组织中均有不同程度的表达。其中,AhCYP302A1在蛹期第6、7天表达量最高,成虫期表达量整体较低;AhCYP306A1在整个生活史中波动表达,以幼虫期第10天表达量最高;AhCYP307A2在末龄幼虫和化蛹初期的表达量较高;以上3个基因在幼虫期和蛹期的表达量较高。AhCYP307A1在卵期高表达,此后各个时期呈波动下降;AhCYP314A1、AhCYP315A1在成虫期和卵期的表达量相对高于其他两个时期。在头、胸、中肠、卵巢、脂肪体5种组织中,除AhCYP307A1外,Halloween家族其他基因在卵巢中表达量均较高;AhCYP307A1在雌成虫头部显著性高表达。【结论】 克隆并鉴定得到6个莲草直胸跳甲Halloween基因家族成员,其在不同发育时期及不同组织中的表达具有一定差异。通过其表达模式推测Halloween基因家族在莲草直胸跳甲幼虫发育及成虫繁殖过程中可能发挥重要作用,对其幼虫蜕皮与成虫卵巢发育均有一定影响。     

苹果蠹蛾几丁质脱乙酰基酶2的基因克隆、表达模式和分子特性

【目的】研究苹果蠹蛾（Cydia pomonella）几丁质脱乙酰基酶2（chitin deacetylase 2,CDA2）的分子特性和表达模式,为新型杀虫剂靶标筛选提供理论依据。【方法】基于苹果蠹蛾转录组和基因组数据,通过同源比对获得苹果蠹蛾CDA2的相关信息;新鉴定的CpCDA2a和CpCDA2b与其他昆虫中已鉴定的CDA2氨基酸序列进行多序列比对,并采用MEGA7软件邻接法（neighbor-joining,NJ）构建系统发育树;通过生物信息软件预测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体的蛋白功能域和三维结构并分析其差异,并通过在线软件对其分子量、等电点和亲/疏水性等蛋白理化性质及糖基化修饰位点等方面进行分析比较;采用荧光定量PCR检测CpCDA2a和CpCDA2b两个剪切体在苹果蠹蛾不同发育时期及其幼虫不同组织的表达情况,以及注射蜕皮激素后其表达量的变化趋势。【结果】获得了苹果蠹蛾CDA2的两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b的全长CDS序列及其内含子和外显子位置信息;分析发现两个剪切体的蛋白序列均具有信号肽、几丁质结合域（ChBD）、低密度脂蛋白受体域（LDLa）和几丁质脱乙酰基催化域（CDA）等功能域。多序列比对和聚类分析结果表明,不同昆虫间CDA2差异剪切类型非常类似,相同目昆虫的序列以较高的置信度聚为一支。三维结构模拟与比较发现两个剪切体的ChBD功能域在结构上存在较大差异;理化性质分析显示两个剪切体的亲/疏水性和糖基化位点也存在差异。不同发育时期表达量分析表明,CpCDA2a主要在幼虫期高表达,CpCDA2b主要在蛹的前期和中期高表达,而且在幼虫蜕皮前和蜕皮后CpCDA2a和CpCDA2b表达量均会显著上调;不同组织的表达量分析表明,CpCDA2a和CpCDA2b均在表皮中表达量最高,而CpCDA2b在头部的表达量也较高。对注射蜕皮激素后幼虫中CpCDA2a和CpCDA2b表达量分析显示,与对照相比在注射蜕皮激素后CpCDA2a的表达量在24 h和48 h均有所上调,但差异不显著,而CpCDA2b在24 h和48 h均显著上调。【结论】苹果蠹蛾CDA2的转录本存在两个可变剪切体CpCDA2a和CpCDA2b,根据对其分子特性、发育阶段和组织表达谱、以及注射蜕皮激素后表达动态等方面的综合分析,推测两者均参与苹果蠹蛾蜕皮和新表皮形成过程,但由于可变剪切的序列差异导致的蛋白结构和理化性质上的差异造成了两者在功能上的分化。