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【目的】探究家蚕热激蛋白(Hsp25.4)基因在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrovirus,Bm NPV)侵染家蚕后的表达变化规律,明确敲低该基因表达后对BmNPV增殖复制的影响,为深入解析BmHsp25.4蛋白在BmNPV侵染家蚕过程中发挥的作用提供参考依据。【方法】以5龄家蚕幼虫为研究对象,经口添食10μL预先制备好的BmNPV-T3株病毒悬液(5×108个/mL),对照组添食等量灭菌水,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因在BmNPV侵染6 h各组织的表达情况,并选择相对表达量较高的3个组织,分析BmHsp25.4基因时空表达图谱;注射双链RNA(dsRNA)检测BmHsp25.4基因在体内的干涉效果,采用实时荧光定量PCR检测BmHsp25.4基因干涉后对BmNPV增殖复制的影响。【结果】BmNPV侵染家蚕6 h,BmHsp25.4基因在家蚕血液、中肠和脂肪体组织中的相对表达量升高;时空表达谱结果显示,BmHsp25.4基因在3个组织中的表达谱均呈先升高后降低的变化趋势,其中血液和中肠组织的相对表达量均在6h达峰值,而脂... 相似文献
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[目的]探究喂食家蚕核型多角体病毒(BmNPV)后家蚕血淋巴和中肠组织抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)]的活性及其基因表达变化规律,明确BmNPV侵染对家蚕抗氧化系统的影响,为解析BmNPV的致病机理提供理论依据.[方法]以五龄家蚕为研究对象,经口喂食BmNPV,分别于添食后6、12、18、24、30、36、42和48 h采集家蚕的血淋巴和中肠组织,采用实时荧光定量PCR检测两种抗氧化酶基因(Bmsod和Bmcat)的表达水平,同时以抗氧化酶活性测试盒测定SOD和CAT的活性变化情况.[结果]BmNPV侵染五龄家蚕能引起典型的血液型脓病,主要表现为蚕体环节肿胀,狂躁爬行,体壁易破,体液呈乳白色等.家蚕血淋巴和中肠组织中Bmsod和Bmcat基因均在感染BmNPV中期开始上调表达,在感染后期呈下调表达趋势,其相对表达量也呈先增加后急剧减少的变化趋势.添食BmNPV后,家蚕血淋巴和中肠组织的SOD活性在感染18和24 h时极显著高于对照组(添食等量灭菌水)家蚕(P<0.01,下同),但从感染30 h起SOD活性开始急剧下降,至感染48 h时降至最低值.家蚕血淋巴和中肠组织的CAT活性在感染早期(6 h)略有下降,从感染12 h起CAT活性开始呈上升趋势,血淋巴CAT活性在感染18~30 h极显著高于对照组,随后急剧下降且显著低于对照组家蚕(P<0.05,下同);中肠组织CAT活性仅在感染18和24 h时显著或极显著高于对照组家蚕,从感染30 h起开始持续下降,至感染48 h时降至最低值,约为对照组家蚕的18%.[结论]BmNPV侵染能影响家蚕机体相关保护酶活性及其基因转录水平,SOD和CAT活性及其基因表达量在感染中期增加,感染后期则急剧降低,提示抗氧化酶SOD和CAT在家蚕的抗病毒过程中发挥重要作用. 相似文献
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云南不同地区BmNPV对家蚕致病力的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
为研究家蚕病毒弱毒株系对强毒株系的交互保护作用,探索利用弱毒苗添食防治家蚕病毒病,试验收集了8种云南不同地区的BmNPV多角体,经纯化后,配制成102~108个/ML7种浓度多角体悬浮液,分别添食3龄起蚕,每种病毒的每种浓度为1个处理,每个处理3个重复小区,每小区30头蚕,调查记录各区蚕死亡头数,连续调查至供试蚕上蔟,累计死亡头数,计算各区蚕死亡率。参照吉田的方法计算其LC。结果表明,8种云南不同地区家蚕核型多角体病毒对家蚕致死中浓度由大到小依次为BmNPV(Heqing)(BmNPV(Xiangyun)(BmNPV(Mengzi)(BmNPV(Qiaojia)(BmNPV(Luliang)(BmNPV(Mojiang)(BmNPV(Zhanyu)(BmNPV(Baoshan)。毒力最强的是保山株,其对3龄起蚕的致死中浓度为5.75×104个/mL,次强是沾益株和墨江株同在一个数量级,陆良株、巧家株和蒙自株中等在同一个数量级,其次是祥云株,最弱为鹤庆株,LC50为8.81×109个/mL,其与最强的保山株(LC50为5.75×104个/mL)相差5个数量级。 相似文献
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家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析 总被引:1,自引:1,他引:0
【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式(BmRelish-FL)是否转变成其活性形式(BmRelishact);利用荧光定量PCR检测过表达BmRelishact的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV(BmNPV-EGFP)感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelishact的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelishact的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelishact的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelishact的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelishact;过表达BmRelishact的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelishact的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelishact的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均>3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量<3 kD的多肽。 相似文献
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追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV)基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因一蛋白、蛋白一蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。 相似文献
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将 Ac MNPV的 polh基因克隆到缺失 polh基因的 Bm NPV(API4)基因组中 ,得到被 Ac MNPV多角体蛋白包埋并可表达慈菇蛋白酶抑制剂的重组病毒 Bm NPV(OAc- API4)。发现它的芽生型病毒能感染家蚕细胞和经皮下注射感染家蚕幼虫 ,但包埋型病毒不能经口感染家蚕幼虫。 相似文献
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家蚕对BmNPV抗病性与中肠消化酶活性的关系 总被引:3,自引:1,他引:3
对6个现行家蚕品种中肠消化酶活性与家蚕对BmNPV病毒抗性比较与分析,以期寻找现行家蚕品种消化酶的活性与抗性的关系,为辅助家蚕育种及品种推广奠定基础.以DNS法测定不同品种海藻糖酶活性,以Fo-lion-酚法测定不同品种蛋白酶活性.以及以铜皂法测定脂肪酶活性,同时对不同品种家蚕4龄起蚕经口添加BmN-PV病毒进行抗性调查分析.结果表明,蛋白酶、脂肪酶酶活顺序为664×663较低,667×668相对较高,其他品种处于中间层次,对应抗性测定结果的相关分析表明,活性越强抗性越强,呈显著正相关关系;而海藻糖酶的活性与抗性的关系没有较好的相关性.因此,家蚕中肠消化液的蛋白酶、脂肪酶可能与家蚕对BmNPV病毒抗性有关. 相似文献
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[目的]全面掌握云南蚕区家蚕品种资源的抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)能力,为挖掘具有特色的家蚕抗病材料及培育适应当地的抗病品种提供参考.[方法]采用三龄起蚕经口添食相同浓度病毒、逐日调查存活率的方法,对200个家蚕品种(品系)进行BmNPV抗性评价和筛选;并通过接种后每日存活数、各发育时期存活率等指标分析云南蚕区家蚕品种资源对BmNPV的抗性水平、发病死亡规律、不同抗性品种的发病死亡时期及同一品种不同品系间抗性差异.[结果]云南蚕区家蚕品种资源中抗BmNPV的品种有731、795、854B、872A、966B、B黄肉色茧、P50、山河B、选二甲白和竹印,感病品种包括955、242A、242B、963B、DW3、锦秀A、锦秀B、日、野乙和云夏A油.各抗病品种和感病品种首次出现死亡差异的时间截点分别是接种后96和48 h,二者相差48 h;部分抗病品种在秋季对BmNPV的抗性水平低于春季;同一家蚕品种A系和B系的抗病性差异不显著(P>0.05).[结论]云南蚕区家蚕品种资源中大多数品种的抗BmNPV能力属于中等水平,其中P50为BmNPV抗性最强品种.对未知品种进行抗BmNPV测定时,可选择接种后168 h作为抗性评价的时间截点. 相似文献
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[目的]探讨抗性品种和非抗性品种家蚕接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后体内羧酸酯酶(Car E)和乙酰胆碱酯酶(Ach E)活性的变化规律。[方法]对抗性品种及其对照品种家蚕添食Bm NPV,测定并比较中肠和血液中羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性变化。[结果]家蚕接种Bm NPV后,抗性品种的中肠中羧酸酯酶活性上升,而对照品种羧酸酯酶活性先升高,然后从第3天开始活性降低。抗性品种前2 d中肠的乙酰胆碱酯酶活性降低,而对照品种与之相反。家蚕接种Bm NPV后,抗性品种在第2天血液羧酸酯酶活性有所升高,此后基本保持不变,而非抗性品种在第3天羧酸酯酶活性升高后下降;抗性品种血液乙酰胆碱酯酶活性升高,对照品种前2 d乙酰胆碱酯酶升高后降低。[结论]抗性品种在感染Bm NPV病毒后其中肠中羧酸酯酶活性高于未感染的抗性品种,表明抗性品种对感染病毒做出了有效应答和防御;而在感染病毒后抗性品种的中肠与血液中乙酰胆碱酯酶活性均变化相对较小。据此推测,抗性品种在感染病毒后仍保持了相对稳定的代谢过程。 相似文献
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[目的]探究家蚕血淋巴中与BmNPV抗性相关铜化合物的分离方法。[方法]选取对BmNPV具有抗性的家蚕品种和非抗性品种为研究对象,对它们进行添食BmNPV病毒处理。提取家蚕的血淋巴,运用SEC-ICP-MS对2组样品中Cu化合物进行分离和检测。[结果]筛选出优化的体积排阻色谱分离条件:Yarra TM SEC-2000分离柱,30 mmol/L Tris-醋酸为流动相(pH 7.4),流速0.5 mL/min。建立了分离与检测家蚕血液中Cu化合物的SEC-ICP-MS联用技术。BmNPV抗性和非抗性家蚕血液中Cu化合物主要的差异是位于7.6 min的组分。[结论]制备了葡聚糖G100凝胶柱分离并收集可能与BmNPV抗性相关的家蚕血液分离液,为家蚕金属蛋白的分离提供更简便有效的方法。 相似文献
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[目的]建立针对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持.[方法]以BmNPV多角体蛋白基因po如为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索.[结果]使用环引物后LAMP对BmNPV基因组DNA的最低检测浓度为7fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短.建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍.在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染.感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本.[结论]针对BmNPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的BmNPV感染早期诊断. 相似文献
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[目的]了解广西家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)毒株gp64基因的保守性,并掌握其具体的突变位点,为研究核型多角体病毒(NPV)种内的微进化模式提供参考依据.[方法]对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序,分析完整开放阅读框(ORF)序列的同源性和单核苷酸多态性,并构建基于gp64基因的遗传进化树.[结果]广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致,存在1590、1593和1599 nt三种类型,是由于第94~96位缺失GCG或第97~102位插入GCGCCG所致,且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现.仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%,其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%~99.2%,其推导氨基酸序列同源性在98.7%~99.6%.19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群(cladeⅠ和cladeⅡ),其中11株独立形成cladeⅡ,7株独立形成cladeⅠ中的一个亚群;广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变,呈一定的规律性.[结论]广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性,在遗传进化上较独立,插入突变显示出地域特点. 相似文献