棉花茎尖农杆菌转化体系的建立

[目的]建立高效的以草甘膦为选择剂的棉花茎尖农杆菌遗传转化体系。[方法]以中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312号4个陆地棉品种茎尖为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导转化法,结合草甘膦筛选,探讨了影响棉花茎尖遗传转化效率的几个重要因素。[结果]棉花茎尖对草甘膦极为敏感,所有品种棉花茎尖均在60μmol／L草甘膦浓度下停止生长。对茎尖用OD600=1．0菌液浸染20min、预培养2d、恢复培养1周和共培养72h的处理能显著提高棉花遗传转化效率。对所有成活转基因棉株进行PCR检测的结果表明,所有植株均能扩增出目的基因aroA—M1 1．3kh的特定条带。[结论]该研究为进一步加速转基因棉花的产业化进程奠定基础。     

芦笋茎尖组织培养技术的研究

1987～1990年对芦笋茎尖组织培养技术进行了系统研究。结果表明:MS+NAA0.1mg/L+BA0.5～1.5mg/L为适宜芽尖成苗培养基;MS+NAA0.1mg/L+KT(或BA)1.0mg/L为适宜继代增殖培养基。激素种类和浓度是影响生根的关键因素,茎尖长度对生根也有一定影响。改良MS+IBA0.5mg/L或改良MS+IBA0.5mg/L+KT0.05～0.1mg/L,为适宜生根培养基。IBA的生根效果优于NAA。根质是影响试管苗移栽成活的首要因素。过渡培养可大大提高芦笋试管苗的移栽成活率。移栽基质以土5份、蛭石3份为最佳。     

农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系优化

生根困难和转化效率较低是农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系的应用瓶颈。本研究以柯字棉312为研究材料,探讨茎尖遗传转化中植物生长调节剂、生根诱导时间、无菌苗型、针刺处理等对茎尖生根率、茎尖形态以及抗性苗产生率等的影响。结果表明,1.5 mg/L NAA能够有效提高生根率,促进茎尖伸长;生根诱导时间是生根率的重要影响因子;经多次针刺处理的正常苗抗性苗率较高;培养5 d的正常苗茎尖生长速度和状态优于黄化苗。     

谷子茎尖愈伤诱导优化及转化影响因素浅析

目前谷子组织培养和转化研究相对较少,不同外植体愈伤诱导以及转化效率相对较低。采用不同谷子品种茎尖作为外植体进行愈伤诱导,分析影响愈伤形成的因素并对诱导条件进行优化,结果表明优化后胚性愈伤诱导率最高可达75.4%,愈伤分化率达15%左右。此外对根癌农杆菌介导转化愈伤进行GUS染色分析,结果表明转化愈伤GUS的瞬时表达效率最高达22.3%。由于用茎尖做外植体不受季节和地域的限制,初步研究结果表明优化后愈伤诱导率大大提高,初步GUS检测表明转化效率也有所提高。该结果为今后谷子组织培养和遗传转化研究提供参考数据。     

谷子茎尖愈伤诱导优化及转化影响因素浅析

目前谷子组织培养和转化研究相对较少,不同外植体愈伤诱导以及转化效率相对较低。采用不同谷子品种茎尖作为外植体进行愈伤诱导,分析影响愈伤形成的因素并对诱导条件进行优化,结果表明优化后胚性愈伤诱导率最高可达75.4%,愈伤分化率达15%左右。此外对根癌农杆菌介导转化愈伤进行GUS染色分析,结果表明转化愈伤GUS的瞬时表达效率最高在22.3%。由于用茎尖做外植体不受季节和地域的限制,初步研究结果表明优化后愈伤诱导率大大提高,初步GUS检测表明转化效率也有所提高。该结果为今后谷子组织培养和遗传转化研究提供参考数据。     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。     

剑麻遗传转化体系的建立与优化

以剑麻无菌苗叶片为试材,研究了潮霉素（Hyg）、菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮（As）及羧苄青霉素（Car）等因素对剑麻遗传转化的影响。结果表明,剑麻最适遗传转化体系为：Hyg选择浓度为25 mg/L,OD600=0.6左右的农杆菌菌液,侵染时间为10～15 min,As浓度为200μmol/L,Car浓度为400 mg/L。     

农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的建立与优化

以“中苜一号”紫花苜蓿品种作为受体材料,建立了适用于农杆菌介导的转基因组培体系,并对GUS 基因进行转化,经 GUS 组织化学染色,以获得抗性愈伤组织分析为目的,转化优化条件为:叶片预培养 4~5 d,用农杆菌菌液(A600=0.3~0.8)侵染 20 min,然后在培养基上铺一层灭菌滤纸共培养 7 d 后清洗。     

棉花茎尖培养及高效植株再生体系的建立

以中棉35号、中棉27、石远321和珂字棉312共4个陆地棉（Gossypium hirsutum L．）品种茎尖为材料,探讨了苗龄、生长调节剂、活性炭和IBA等因子对茎尖培养和再生的影响。结果表明,5d苗龄的茎尖、0．1mg／L 6-BA＋0．1mg／L α—NAA最适于不定芽的诱导,3g／L活性炭和0．4mg／L IBA对根诱导与植株再生效果最佳,再生频率平均可达86．8％。实验结果初步建立了棉花茎尖的再生体系,为棉花茎尖的遗传转化奠定了基础。     

农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

蝴蝶兰高效再生体系与遗传转化体系的建立

为建立蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)再生体系和遗传转化体系,对蝴蝶兰进行人工授粉,成熟后将胚播种于诱导培养基上诱导原球茎或不定芽。探讨外源调节剂的种类及浓度,并筛选卡那霉素浓度以及除菌剂的种类及浓度。结果表明:当6-BA浓度为5 mg·L~(~(-1)),NAA浓度为1 mg·L~(-1)时,原球茎的诱导效率最高。当6-BA浓度为1.5mg·L~(-1),同时添加0.5g·L~(-1)活性炭和40mL·L~(-1)椰汁时,壮苗效果最佳。卡那霉素的筛选浓度为4mg·L~(-1),除菌剂的种类为阿莫西林克拉维酸钾(7∶1),除菌浓度为100mg·L~(-1)。     

紫花苜蓿高效遗传转化受体系统的建立

以新疆大叶和新牧一号苜蓿下胚轴和子叶为材料,研究了不同基因型、外植体、培养基及激素配比对其愈伤组织诱导、芽分化和根诱导的影响,建立了适用于这2种苜蓿的再生体系。结果表明,下胚轴是一种较好的外植体材料,其再生能力高于子叶,最高再生率为54.96%;0.2 mg/L KT能辅助2,4-D对愈伤组织的诱导发挥更好的作用;SH培养基相对于MS培养基对愈伤组织的诱导更有效,而MS培养基则有利于愈伤组织的分化;适用于2种苜蓿愈伤组织诱导、分化及生根培养的培养基分别为SH(附加2 mg/L 2,4-D和0.2 mg/L KT),MS(附加1.0 mg/LBAP和0.3 mg/L NAA)和不含激素的1/2 MS(扩繁时附加1 mg/L IBA)。     

马铃薯高效遗传转化受体体系的建立

以4个马铃薯(Solanum tuberosum L.)栽培种为材料,对其叶片、茎段和试管薯3种外植体再生体系进行研究,筛选与优化马铃薯遗传转化的受体材料和条件,建立马铃薯高效遗传转化受体体系。结果表明:茎段较叶片愈伤组织形成速度更快、诱导率更高。其中,‘陇薯3号’愈伤组织分化效果最佳,分化率和出苗率分别达100%和175.0%。在添加1.0mg·L~(-1)ZT+1.0mg·L~(-1) IAA+0.5mg·L~(-1)6-BA+0.2mg·L~(-1) GA的MS培养基中,4个品种的试管薯均可通过直接分化再生系统分化成苗。其中,以‘青薯168’试管薯薯片出苗率最高(110.0%)。验证了试管薯作为转化受体,受基因型的影响小,转化周期短,是马铃薯遗传转化的最佳材料,进一步建立试管薯繁育及再生体系,为马铃薯遗传转化奠定良好的基础。     

二倍体栽培马铃薯高效遗传转化体系的建立

【背景】马铃薯是最重要的块茎类粮食作物。栽培马铃薯以四倍体为主,但四倍体遗传和薯块繁殖增加了马铃薯改良的难度。因此越来越多的科学家呼吁在二倍体水平进行马铃薯的再驯化,将马铃薯驯化成种子繁殖作物。自然界中存在4个二倍体马铃薯原始栽培种,这些二倍体栽培种中蕴含着丰富的遗传变异,但是它们的遗传转化体系尚未成熟。【目的】建立高效的二倍体栽培马铃薯遗传转化体系,为二倍体马铃薯优良等位基因和分子育种提供工具。【方法】以二倍体栽培种马铃薯(Solanum phureja)CIP 703541为试验材料,利用绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,对遗传转化体系进行摸索,主要包括:预处理培养时间、诱导再生的激素比例、抗生素浓度以及转化效率。另外,利用同样的激素组合对17份不同基因型的二倍体马铃薯原始栽培种进行了测试,比较各个材料在不同激素浓度条件下的再生效率,筛选出再生效率较高的激素组合进行大量遗传转化;对再生苗进行生根筛选、荧光观察和PCR鉴定,统计阳性植株的概率。用流式细胞仪检测阳性植株的倍性,以分析再生植株发生染色体加倍的频率。【结果】预处理培养时间为2 d的外植体浸染效率最高。二倍体材料CIP 703541最适合再生出芽的激素配方为2.0 mg·L~(-1)玉米素(zeatin,ZT)﹕0.01 mg·L~(-1)奈乙酸(naphthaleneacetic acid,NAA)。再生阶段抗生素卡那霉素(kanamycin,Kan)的最适筛选浓度为100 mg·L~(-1),生根阶段的最适筛选浓度为50 mg·L~(-1)。通过对不同基因型进行筛选,获得3份再生能力较强的二倍体马铃薯材料(CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541)。它们响应的激素配方各不相同,在添加了100 mg·L~(-1)卡那霉素的再生培养基中,3份材料的再生效率分别为45%、40%和52%。通过大规模遗传转化证明,3份材料的转化率分别为2.8%、4.2%和5.3%。经流式细胞仪检测,所获得的马铃薯阳性植株中四倍体的比例较高,CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541的阳性转化植株中二倍体的比例分别为5.26%、10.53%和38.46%。【结论】建立了高效的二倍体马铃薯遗传转化体系,获得了3份再生能力较强的二倍体材料。另外,发现二倍体马铃薯在经过遗传转化之后再生植株中染色体加倍的比例较高。     

百合遗传转化高频直接分化受体系统的构建

以东方百合西伯利亚和索蚌为试材,通过对鳞片分化成苗、小叶离体再生、生根和抗生素敏感性试验等研究,建立了稳定、高效的以无菌苗叶片为外植体的高频直接分化基因转移受体系统。在含有BA2mg/L+ZT1mg/L的MS培养基上,对供试品种无菌苗小叶片进行离体分化培养,再生率达100%,其适宜的生根培养基为MS+NAA0.75mg/L。同时,对小叶片外植体再生体系的抗生素及除草剂筛选浓度进行试验,结果显示:小叶片对G418和PPT较敏感,适宜的G418筛选浓度为80mg/L,PPT筛选浓度为1.75mg/L;而羧苄青霉素适宜浓度范围较宽,为300～400mg/L。     

橡胶草高效再生体系的建立和优化

[目的]优化橡胶草再生和遗传转化体系。[方法]以橡胶草茎和叶为外植体,以1/2MS和MS为基本培养基,研究不同激素浓度配比、外植体类型和激素浓度对橡胶草不定芽诱导和生根的影响。[结果]橡胶草进行组织培养的最佳外植体类型为茎,诱导不定芽形成的最佳激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA。诱导不定芽生根的最佳激素浓度为0.10 mg/L NAA,生根率达100%,移栽成活率达95%以上。[结论]建立了橡胶草高效再生体系,对提高橡胶草组织培养的效率和转化率具有重要意义。     

烟草转硝酸还原酶基因高效遗传转化研究

通过对农杆茵介导烟草遗传转化方法的优化,建立了快速高效烟草叶盘遗传转化体系.用0D600为0.5的农杆茵悬浮液浸染大小约1.0 cm×1.O cm烟草叶盘5～10 min,再置于MS附加2.25 mg/L 6-BA和0.10 mg/LNAA的分化培养基上,在100 mg/L卡那霉素选择压下,21～28 d可获得抗性不定...     

黄瓜高效遗传转化体系的建立及银杏抗菌肽转化

建立黄瓜的高效再生和遗传转化体系,并进行银杏抗菌肽GK-2的遗传转化。研究结果表明,MS6(MS+0.005 mg/L TDZ+0.20 mg/L IAA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽分化,7 d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。进一步用带有银杏抗菌肽GK-2目的基因的农杆菌转化黄瓜,筛选出了侵染时间20 min、共培养时间3 d以及卡那霉素抗性筛选质量浓度为100 mg/L的最佳转化体系。利用该体系转化黄瓜,获得的转化植株阳性率高达17.9%,并对黄瓜枯萎病表现出明显的抗性。     

毛白杨85号高效遗传转化系统的建立

在建立以毛白杨85号(Populus tomentosa 85)叶片为外植体的再生系统基础上,从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性植株作为转化率的衡量指标,研究了各因素对毛白杨85号遗传转化率的影响,建立了高效的遗传转化系统。筛选的高效转化系统为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5min,共培养4d。毛白杨85号叶盘转化率可达40.0%。该研究为利用叶盘法开展毛白杨85号基因转化培育抗逆新品种奠定了良好基础。