基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发

【目的】鉴定花生RNA-seq数据中的SSR位点,明确转录组中SSR位点的分布和结构特点,开发与花生基因相关联的SSR标记,为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据,使用MISA软件分析SSR位点分布及特征,采用Primer 3设计基因关联的SSR引物,并利用电子PCR软件对引物的质量进行检测,随机合成38对引物,进行多态性检测。【结果】从52 280条转录本中共鉴定19 143个SSR位点,分布于14 084条转录本,发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸,以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR位点数最多,分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT和AACAC/GTGTT,占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47次,单个SSR位点的长度的分布范围为10—47 bp,基序长度主要集中在10—14 bp;复合SSR位点的长度范围为21—249 bp,以31—40 bp为主。鉴定的SSR位点中共有13 477个SSR位点可以进行引物设计,其中5 020条转录本序列对应到特定的基因,共包含5 859个可进行引物设计的SSR位点,这些SSR位点在A基因组和B基因组共20条染色体上不均匀分布,其中B03染色体上SSR位点最多,为484个。对特定基因SSR引物进行电子PCR检测,在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929和10 188个,有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对,在A. hypogaea基因组中,SSR引物扩增位点主要以2个位点为主,其中,有1 477对引物单位点扩增。根据SSR引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38对SSR引物中,共有35对（92.1%）SSR引物可以扩增出清晰的条带,其中,有11对（28.9%）SSR引物在2个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477个可进行标记开发的SSR位点,开发、检测了5 859个基因相关SSR标记,在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率,并构建了基因相关SSR位点的物理图谱。     

大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析

【目的】分析大花序桉基因组SSR的分布特征及序列分析,为大规模开发大花序桉分子标记辅助育种的SSR标记提供理论依据。【方法】通过高通量测序获得大花序桉基因组序列信息,经严格过滤、拼接和组装后获得scaffolds,利用MISA网站对Scaffolds进行SSR位点检索及分析,并利用Primer 5.0对具有较大多态性开发潜力（二基元重复次数≥10、三基元重复次数≥7）的SSR标记进行引物设计,随机挑选48对基因组SSR引物进行有效性检测及有效扩增引物筛选。【结果】大花序桉基因组共含有177750个SSR位点,包括171530个SSR独立位点和6220个复合型SSR位点;SSR发生频率为17.86%,分布密度为1/3.13 kb。大花序桉基因组SSR基元类型较丰富,以单核苷酸重复基元类型数量最多,占基因组总SSR数量的69.33%,其次为二、三核苷酸重复基元类型,分别占基因组SSR数量的21.01%和7.58%,四、五、六核苷酸的重复基元类型所占比例均相对较低,三者的比例含量总和为2.08%。SSR基元类型以AG/CT占绝对优势（16812个）,其次为AT/AT（8193个）和AAG/CTT（4404个）。从48对SSR标记引物中筛选出31对引物能有效扩增出清晰、明亮条带且大小与预期相符,其中有14对在6个大花序桉样本中均呈现多态性,多态百分率为29.17%。【结论】大花序桉基因组SSR位点发生频率高,基元类型较丰富,SSR多态性标记开发潜力大。该研究结果为进一步大花序桉SSR引物开发和筛选,以及开展大花序桉及其他桉树遗传多样性分析和遗传图谱构建提供依据。     

苦荞全基因组SSR位点鉴定及分子标记开发

【目的】系统鉴定苦荞基因组中的SSR位点并开发SSR分子标记,为SSR分子标记在苦荞中的应用奠定基础。【方法】利用MISA1.0软件对苦荞“品苦1号”全基因组序列中的SSR位点进行搜索,同时利用Primer 3.0批量设计引物,并随机选择50对引物进行多态性验证。【结果】共鉴定到148 830个SSR位点,他们分布在苦荞所有8条染色体上,平均每隔3.04 kb就有1个SSR位点。SSR有6种类型,即单核苷酸重复至六核苷酸重复,其中单核苷酸重复(82 047个)、二核苷酸重复(52 039个)和三核苷酸重复(11 699个)最多,占SSR总数的97.95%。全基因组共鉴定出171种碱基重复类型,其中A/T(53.143%)和AT/AT(30.038%)是最丰富的重复类型。共设计出128 706对SSR引物,随机选择合成50对引物对10份苦荞种质进行多态性检测,共有15对引物在苦荞种质中产生了较好的多态性,并可将10份苦荞种质分为4个类群。【结论】苦荞基因组含有丰富的SSR位点,其中单核苷酸重复和二核苷酸重复类型最为丰富,SSR位点平均距离为3.04 kb;开发的SSR分子标记具有良好的多...     

苹果基因组SSR位点分析与应用

 【目的】通过对‘金冠’苹果基因组SSR位点的统计分析,为蔷薇科果树应用SSR分子标记进行高通量的遗传分析提供理论与实践基础。【方法】运用NCBI数据库中‘金冠’苹果基因组数据,分析其SSR位点分布情况,并根据SSR位点的搜索结果,设计68对引物（每条染色体设计4对）,利用苹果品种对所设计引物进行应用性验证并利用梨杂交群体进行通用性检测。【结果】苹果基因组中SSR序列主要是完全重复型,17条染色体共存在163 426个SSR位点,平均每隔3.22 kb存在1个。单核苷酸至三核苷酸重复基序在染色体水平上分布较均匀,而四核苷酸至六核苷酸重复基序的分布差异较大。单核苷酸与二核苷酸重复基序所占比例最大,两者占基因组内SSR位点总数的91.67%,单核苷酸重复基序主要以A/T重复为主,二核苷酸的重复基序主要以AT/TA重复为主。在苹果品种中验证所设计的68对引物,有62对可以扩增出预期目的片段,37对存在扩增多态性。在梨杂交群体上应用所设计的68对引物,有40对具扩增目的片段,其中16对具扩增多态性。【结论】苹果基因组内SSR分布呈现一定的规律性,初步验证SSR位点在亲缘关系较近的物种间高度保守并可以通用,基于基因组数据发掘SSR位点用于后续的相关遗传研究具有可行性。     

柴胡转录组SSR的分布及序列特征分析

【目的】分析柴胡转录组中SSR的分布及序列特征,为开发多态性良好的、功能基因相关的SSR标记提供理论依据。【方法】以不同温度处理的柴胡种子为材料,经高通量转录组测序后,使用Trinity对测序结果进行de novo组装,并利用MISA对组装得到的Unigenes进行SSR位点搜索,最后统计分析SSR的分布及序列特征。【结果】从转录组数据组装获得244194条Unigenes,其N50值为1036 bp,平均长度791 bp,总长度193138105 bp。从Unigenes序列中共检测到50303个SSR位点,去除20405个复合型SSR位点,以29898个单一型SSR位点为后续分析对象。转录组SSR的出现频率为12.24%,平均分布距离6.46 kb,主要重复基元类型为二核苷酸,共17105个,占SSR总数的57.21%,其次为三核苷酸和单核苷酸,分别占SSR总数的20.75%和20.46%,四核苷酸~六核苷酸重复基元数量均较少。转录组SSR中,共有97种重复基元,其中二核苷酸和三核苷酸重复基元分别以AT/AT和ATC/GAT为主,分别占SSR总数的33.33%和3.98%;重复次数5~10次的SSR位点数量最多,共27942个,占SSR总数的93.46%。转录组SSR序列长度存在明显差异（12~76 bp）,平均长度15.28 bp。【结论】柴胡转录组的SSR位点出现频率较高,类型较丰富,具有开发出高多态性SSR分子标记的潜力,将其用于柴胡的遗传多样性分析、种质资源评价及分子标记辅助育种等研究。     

越橘EST-SSR分子标记的开发及其遗传多样性分析

【目的】探讨越橘EST序列中SSR位点的分布规律,开发越橘EST-SSR引物,并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用。【方法】以91份越橘种质为材料,利用越橘果实转录组(RNA-Seq)的测序结果,通过SSRIT在线搜索,利用Primer Premier 5.0软件设计30对引物,并筛选扩增效果理想的引物,用筛选出的引物分析91份种质的多态性,构建91份种质的系统发育树。【结果】34 464条越橘unigene序列中含有SSR位点的序列有829条,SSR位点有913个,其中二核苷酸、三核苷酸重复是主要的SSR类型,分别占全部SSR位点的13.69%和81.27%。不同核苷酸数目重复基元的重复次数差异很大;越橘EST-SSR位点集中在11~15bp;三核苷酸和六核苷酸重基元复种类最多,在所有重复基元中GAA/TTC发生频率最高。设计的30对引物中有17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR产物,17对引物均有多态性。聚类分析结果显示,在遗传相似系数为0.69时,可以将供试越橘种质分成4组。【结论】EST-SSR标记可以用于越橘品种的鉴定与遗传多样性分析。     

普通烟草及其祖先种基因组SSR位点分析

【目的】普通烟草(N.tabacum,2n=24Ⅱ=48 TTSS)及其2个祖先种-绒毛状烟草(N.tomentosoformis,2n=12Ⅱ=24 TT)和林烟草(N.sylvestris,2n=12Ⅱ=24 SS)基因组SSR位点信息的统计分析,有助于烟草属植物的遗传分析。【方法】从公共数据库NCBI(National Center for Biotechnology Information)中下载上述3个烟草基因组数据,应用SSRIT和TRF软件分析其各自SSR位点分布特征,每个基因组随机合成50对SSR引物扩增多态性。【结果】在绒毛状烟草基因组、林烟草基因组和普通烟草基因组中分别获得218 081、263 478和397 432个SSR总位点,其间的平均距离分别为7.52、7.78和9.06 kb。绝大部分的SSR位点分布在内含子和UTR(尤其是5′-UTR)区域;以2核苷酸和3核苷酸类型为主,占基因组内SSR位点总数目的 2/3以上,其中,2核苷酸类型丰度最高;含有A(T)n基序结构的频率及数量最高;除单核苷酸类型外,重复次数多在3—10。150对合成的引物对8个烟草种DNAs进行PCR反应,所有材料均能扩增出清晰稳定的目标片段,其中36对引物显示多态性。【结论】绒毛状烟草、林烟草和普通烟草基因组内SSR呈现一定的分布特征,表明SSR位点在亲缘关系相对较近的烟草种间具有高度保守性。     

草原1号杂花苜蓿花蕾转录组SSR序列特征

【目的】对草原1号杂花苜蓿花蕾转录组微卫星SSR特征进行分析,为开发新的分子标记和辅助育种选择研究奠定基础。【方法】利用MISA软件对草原1号杂花苜蓿花蕾转录组数据进行简单重复序列(SSR)位点搜索,并对SSR分布及其序列特征进行分析。【结果】在286 409条非冗余单基因簇(Unigene)序列中共挖掘到57 368个SSR位点,SSR出现频率为20.03%,平均分布距离5.84 kb。重复基元数量以单核苷酸(68.45%)为主,三核苷酸(16.46%)次之。在129种重复基元中,以A/T类型基元(68.15%)最高,其次为AG/CT基元(6.56%)。SSR基元重复次数主要集中在6～15次,核苷酸数量随着基元重复次数的增加而减少。SSR长度主要集中在12～40 bp(55.58%),具有较高多态性潜能的SSR(长度≥20 bp)位点数为9 166(15.98%)。【结论】草原1号杂花苜蓿SSR位点出现频率高、基元重复次数和类型丰富、多态性潜能高,可用于苜蓿遗传多样性与品种的分子鉴定及分子标记辅助选择。     

蒙农红豆草花瓣转录组微卫星SSR特征分析

【目的】对蒙农红豆草花瓣转录组微卫星SSR特征进行分析,为开发新的分子标记及探明各类性状的遗传机制研究奠定基础。【方法】以蒙农红豆草突变群体中浅色花瓣和紫红色花瓣（对照）为试验材料,通过Illumina HiSeq^TM 2000对其进行高通量测序和组装,利用MISA软件对其所有Unigene进行SSR搜索,并对SSR分布及其序列特征进行分析。【结果】在蒙农红豆草转录组数据中共获得53 009条Unigene,其中6 202条Unigene上分布了8 175个SSR位点,每5.86 kb就有1个SSR位点;重复基元数量以三核苷酸为主（49.13%）,二核苷酸次之（22.07%）;在284种重复基元中以AG/CT类型最高（16.16%）,其次为AAG/CTT（14.30%）;三核苷酸基元重复次数种类最多（11种）,二核苷酸次之（10种）。随着基元重复次数的增加,核苷酸数量减少。蒙农红豆草SSR长度为12～441 bp,主要集中在12～24 bp,其中具有高度多态性潜能的SSR（长度≥20 bp）有3 130条（38.29%）。【结论】蒙农红豆草SSR位点出现频率高、基元类型丰富、分布密度大、多态性潜能高,在红豆草基因定位和分子标记辅助育种等方面具有较大的应用价值。     

丁香假单胞菌基因组内简单重复序列的比较分析

【目的】分析丁香假单胞菌3个致病变种基因组内简单重复序列(simple sequence repeats,SSR),为病菌SSR标记开发和遗传多样性研究提供有用信息。【方法】基于公共的基因组数据库资源,对3个菌株的完全重复SSR和不完全重复SSR的丰度和组成类型等进行分析。【结果】3个菌株完全重复SSR的分布规律较为相似,其中单碱基的短重复SSR均占绝对优势,多碱基和长重复SSR则较少;菌株B728a、1448A和DC3000的不完全重复SSR总数也较相近,分别为562、529和567,其中数量最多的均为六碱基重复。但3个菌株以四、五和六碱基为基序的SSR在基序组成和数量上则表现出较高的变异性,完全重复SSR中,除AGCC、ACCTGC等基序在两个菌株中同时出现,绝大多数基序仅在单个菌株基因组内出现;不完全重复SSR中,部分基序如CCCTG、ACGCA等的出现频率在不同菌株间存在明显差异。【结论】3个菌株的不完全重复SSR在数量和结构类型上均具有较大的相似性,而菌株间的完全重复SSR在数量和组成上则存在一定差异。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

利用Target SSR-seq技术鉴定60份柑橘种质资源

【背景】 芽变是植物分生组织体细胞所发生的DNA突变，从而引起枝、叶、花、果及物候期、成熟期等系列表型特征的改变，其变异性状可遗传。然而由于环境条件、栽培技术等，植物可能产生彷徨变异，这种变异不可遗传。【目的】 利用高通量测序技术建立一套适用于柑橘芽变资源鉴定的方法，为柑橘种质资源的收集、保存、鉴定提供技术支撑。【方法】 为提高芽变材料的分子鉴定能力，本研究通过对‘克里曼丁’以及‘温州蜜柑’全基因组数据以及‘温州蜜柑’GSS、EST数据进行分析、比对，筛选出多态性高的位点用于深度测序。根据引物互补结构对引物进行分组后用于多重扩增检测及构建双端测序文库，构建好的文库通过Miniseq平台完成高通量测序，使用生物信息学方法对下机数据进行后续分析。【结果】 通过对大量测序数据的分析、比对，本研究共设计出77对用于柑橘芽变鉴定的SSR引物，根据引物互补结构，将引物分成18个组合。通过对60份柑橘材料进行Target SSR-seq分析，所设计引物可以将所测试的柑橘种质资源分为甜橙和宽皮柑橘，在宽皮柑橘中可细分为‘沃柑’‘椪柑’以及杂柑等栽培种，对于栽培种内芽变资源也具有较好的鉴别能力。在7个‘塔罗科’血橙芽变中发现11个SSR变异位点，2个‘五月红’芽变中发现8个SSR变异位点，5个脐橙样品中发现8个SSR变异位点，9个‘冰糖橙’品种中发现16个SSR变异位点，2个‘砂糖橘’芽变中发现9个SSR变异位点，4个‘温州蜜柑’芽变中发现15个芽变位点，8个‘沃柑’芽变中发现21个SSR变异位点，‘沃柑’杂交品种中发现11个SSR变异位点，在‘椪柑’中发现14个SSR变异位点。在SSR位点变异中，‘塔罗科’血橙以ATT基序最多，‘五月红’以TAA基序最多，脐橙以TAA基序最多，‘冰糖橙’以GA基序最多，‘砂糖橘’以AAT基序最多，‘温州蜜柑’以AAT基序最多，‘沃柑’芽变资源以AAT基序最多，‘沃柑’杂交资源以TAA、GA基序最多。【结论】 使用Target SSR-seq技术建立了一套高效的柑橘芽变鉴定方法。对所试验的60份柑橘资源具有鉴别能力，SSR基因分型信息准确、可靠，可用于柑橘种质资源管理和品种知识产权保护。     

利用Target SSR-seq技术鉴定温州蜜柑芽变材料

【目的】柑橘芽极易发生变异,用形态学的方法鉴定这些芽变材料,易受环境、栽培条件等因素影响,而利用深度测序技术开展柑橘芽变材料鉴定,能够获得变异位点的基因型;同时,建立的技术体系也有利于柑橘资源的精准鉴定、种质资源的遗传多样性研究和植物性品种权保护。【方法】本研究通过靶位点SSR测序技术对柑橘芽变材料开展鉴定。首先利用柑橘全基因组序列扫描发掘SSR,采用多态性较高的SSR位点用于柑橘芽变材料的区分,进一步利用多路复用PCR扩增构建SSR靶位点文库,并通过MiSeq深度测序方法对2份温州蜜柑芽变材料的SSR靶位点进行测序验证。再利用开发的SSR标记对22份优质柑橘种质资源进行遗传多样性分析。【结果】利用GMATA软件在克里曼丁红橘(Citrus clementina Hort. ex. Tanaka)参考基因组和温州蜜柑(Citrus unshiu Macf.)基因组中分别获得69 101个和80 193个SSR,其中以AT/TA为主的2基序SSR最多,3基序中以AAT最多,通过序列比对发掘出变异热点区域的高多态性SSR用于温州蜜柑芽变材料的检测,4对SSR引物能对22份柑橘材料进行准确区...     

尖镰孢EST-SSR信息分析及分子标记建立

【目的】探讨尖镰孢（Fusarium oxysporum）表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列中简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点的分布特点,开发尖镰孢EST-SSR引物,为镰孢菌遗传多样性分析提供技术支持。【方法】从NCBI公共数据库下载尖镰孢EST 9 304条,利用SSRIT软件查找SSR位点,Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离SSR-PCR扩增产物,并选用能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的引物,对23株尖镰孢菌株进行SSR遗传多样性分析。【结果】在尖镰孢EST序列中,共搜索到92个SSR位点,分布于90条EST序列中,出现频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型是最主要的SSR类型,占总SSR的比例为59.78%。其次为三核苷酸与五核苷酸重复类型,占总SSR的比例分别为17.39%、11.96%。出现频率最高的基序是（AC/GT）（0.51%）。设计合成的30对引物中有20对（66.7%）能够有效扩增,其中14对引物（46.7%）能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的产物。尖镰孢的遗传多样性分析结果表明,利用筛选出的14对引物扩增出62条条带,其中多态性条带59条,多态性位点比例为95.2%,平均每对引物可扩增4.2条。供试菌株间的遗传相似系数为0.487-0.933,平均为0.686。供试菌株间存在明显的遗传分化。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.781时,除14号菌株外,所有菌株均根据寄主来源划分为不同的SSR类群。【结论】基于尖镰孢EST序列开发SSR标记是一种简便有效的方法,研究开发的14对引物可用于尖镰孢的遗传多样性分析。