VgDGAT1A转基因大豆高代材料的表型分析

[目的]二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成的最后一步限速酶,对油脂积累至关重要,可用于提高大豆(Glycine max)种子油含量。[方法]本文将来自富油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)发育种子的VgDGAT1A基因转入大豆品种Jack,进一步培育获得VgDGAT1A转基因大豆高代品系。通过qRT-PCR检测VgDGAT1A基因在大豆种子发育中期的表达情况及其引起的脂肪酸含量变化。[结果]连续多代跟踪检测表明,这些大豆品系中VgDGAT1A基因稳定整入染色体,并有效表达。与野生型大豆(Jack)相比,转基因大豆种子油脂含量平均提高5.1%,没有其它不良表型。[结论]VgDGAT1A基因确实能够在大豆种子发育过程中促进油脂合成累积,从而提高大豆种子的总体含油量。这些富油转基因品系可进一步用于培育高油大豆品种,以及大豆种子油脂合成积累及其调控机制的研究。     

在中国大豆品种上创建ALSV诱导的基因沉默体系

【目的】在中国大豆品种上建立以苹果潜隐球形病毒（apple latent spherical virus,ALSV）为载体的基因沉默体系,为中国大豆品种的基因功能和遗传育种提供一种简便、省时、易操作的技术体系。【方法】构建以农杆菌介导接种的ALSV病毒侵染性克隆载体。从大豆品种威廉姆斯82（Williams 82）中特异扩增327 bp的八氢番茄红素脱氢酶（GmPDS）基因cDNA片段,插入病毒载体pALSV2。通过农杆菌浸润法将病毒载体导入模式植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）,17 d后富集病毒粒子,摩擦接种大豆第一轮真叶,以接种病毒空载作为对照组,持续观察测试大豆植株系统叶表型,并结合逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）或荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ALSV衣壳蛋白基因（CP）和GmPDS的表达水平。【结果】ALSV﹕GmPDS接种大豆品种威廉姆斯82和南农1138-2,20 d后,前者系统叶未见白化表型,而后者系统叶出现明显的白化表型;qRT-PCR检测结果表明,发生白化的南农1138-2植株中GmPDS的表达水平显著降低,未出现白化表型的威廉姆斯82中GmPDS的表达水平没有出现显著变化。在此基础上,采用相同的方法,测试了ALSV在其他9种大豆品种中诱导GmPDS的沉默效率,发现在南农47、安豆203、祥斗4号、中黄13、山宁29、齐黄34等大豆品种上接种ALSV﹕GmPDS后植株系统叶均产生白化表型,而菏豆12、中黄311和山宁16等3个品种的GmPDS均不能诱导有效沉默。【结论】构建了农杆菌介导的ALSV病毒载体,利用本氏烟扩繁富集ALSV病毒,将提纯的病毒粒体摩擦接种大豆真叶,在多个中国大豆品种上成功建立了基因沉默体系。     

大豆类黄酮糖基转移酶基因UGT73C19的功能研究

【背景】 类黄酮是大豆中积累的一类重要的植物次生代谢产物,参与大豆的生长、发育和抗逆等诸多生理活动。由UDP-糖基转移酶（UGT）催化的糖基化修饰是类黄酮生物合成的关键步骤。【目的】 通过系统研究大豆UGT73C19编码重组酶的体外酶活特性和体内特性,完善大豆黄酮类化合物合成和积累的机制,为大豆品质的遗传改良提供基因资源和理论基础。【方法】 通过高效液相色谱（HPLC）的方法检测大豆核心种质资源叶片中类黄酮的种类和含量,通过qRT-PCR的方法检测了UGT的表达水平。以大豆Williams 82叶片cDNA为模板,克隆得到UGT73C19的编码区序列。使用MEGA5和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建进化树。通过原核表达系统获得UGT73C19的重组蛋白,分析UGT73C19重组蛋白对各种类黄酮苷元的糖基转移活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对产物进行鉴定,确定重组蛋白的糖基化位点。利用qRT-PCR技术对UGT73C19在大豆不同组织的表达水平进行分析。构建植物过量表达载体,通过花序浸染法转化拟南芥,获得UGT73C19表达量高的纯合株系,检测转基因株系叶片和种子中类黄酮的种类和含量。【结果】 通过HPLC分析大豆核心种质资源叶片类黄酮成分,发现不同品种中类黄酮的成分和含量存在明显差异。根据类黄酮成分的不同,将大豆核心种质分为12种不同的类型。大豆核心种质资源叶片中总黄酮的含量与UGT73C19的表达水平呈正相关关系。克隆得到UGT73C19的编码区序列,全长1 482 bp,编码493个氨基酸,UGT73C19蛋白在C-端有一个保守的PSPG结构域。体外酶活分析表明,重组的UGT73C19蛋白对6种类黄酮苷元（山奈酚、槲皮素、杨梅素、芹黄素、大豆苷元和染料木素）都具有糖基转移活性,其中对槲皮素的催化效率最高;糖基化位点分别位于类黄酮的5位和7位羟基上,重组UGT73C19蛋白的糖基化底物和位点具有多样性。过量表达UGT73C19的拟南芥叶片和种子中的类黄酮总量明显升高,其中叶片中总黄酮含量提高49%—70%,种子中总黄酮的含量提高34%—37%;尤其是种子中槲皮素3-O鼠李糖的含量显著增加。【结论】 UGT73C19蛋白是催化合成大豆中多个类黄酮糖苷的关键糖基转移酶,过量表达UGT73C19可以提高转基因植物中黄酮醇糖苷和类黄酮的含量。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

施用草甘膦对转基因抗除草剂大豆田杂草防除、大豆安全性及杂草发生的影响

【目的】转GAT 和EPSPS 双价基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’是我国具有自主知识产权的抗除草剂材料,喷施草甘膦后,评价草甘膦对杂草防除、大豆安全和杂草发生的影响,为其将来商业化种植后的安全监测与杂草治理提供数据支持。【方法】除草效果：每小区以对角线5点取样法取5个0.25 m ²样点并标记,施药后28 d调查禾本科和阔叶杂草株数,并剪取地上部分称取鲜重, 计算株防效和鲜重防效。对大豆安全性：每小区以对角线5点取样法,每点随机取4株大豆并标记,在喷药当天、药后7、14、21及28 d调查大豆株高和复叶数,观察药害,收获前每小区取50株大豆调查结荚数及产量。杂草发生情况：每小区以对角线5点取样法取5个0.25 m ²样点并标记（避开除草效果取样点）,调查并记录每种杂草种类、株数,计算每种杂草相对多度。【结果】转基因大豆喷施900、1 800和3 600 g a.i./hm ²草甘膦对禾本科杂草株防效2016年分别为84.30%、95.22%和83.62%,阔叶杂草株防效分别为49.80%、64.52%和61.93%,禾本科和阔叶杂草鲜重防效分别在95.36%和82.05%以上,2017年对禾本科和阔叶草株防效分别达94.93%和85.09%以上,对禾本科和阔叶杂草鲜重防效分别达98.00%和96.57%以上。转基因大豆喷施草甘膦对大豆生长没有不良影响,产量高于人工除草处理。两年研究结果表明转基因抗除草剂大豆喷施草甘膦后杂草群落发生改变,转基因抗除草剂大豆田不除草处理小区主要优势阔叶杂草为反枝苋（Amaranthus retroflexus）、打碗花（Calystegia hederacea）、马齿苋（Portulaca oleracea）,禾本科杂草为狗尾草（Setaria viridis）、马唐（Digitaria sanguinalis）和牛筋草（Eleusine indica）,共6种,喷施草甘膦900—3 600 g a.i./hm ²后转基因大豆田5种主要优势杂草为打碗花、夏至草（Lagopsis supina）、马齿苋、牛筋草和狗尾草。【结论】转基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’喷施草甘膦900—3 600 g a.i./hm ²对杂草有很好的防除效果, 对大豆安全。因此,转基因抗草甘膦大豆‘GE-J16’将在我国有很好的商业化应用前景,喷施草甘膦影响杂草种群的发生,如今后商业化种植需长期密切监测种群变化。     

日粮添加植物油籽对乳脂脂肪酸的影响

 【目的】 研究日粮中添加国内广泛种植的几种植物油籽对中国荷斯坦奶牛乳脂脂肪酸组成影响，为改变牛奶脂肪酸组成，提高乳品质寻找合适的途径。【方法】 选用40头泌乳中期（150±25d）、胎次（3±1胎）的中国荷斯坦奶牛，采用完全随机试验（对照组、全脂整粒大豆组、混合油籽组以及全脂膨化大豆组）设计。试验期6周，牛奶样品于试验第4、5和6周采集，利用气相色谱仪分析样品脂肪酸组成。【结果】与对照组相比，日粮添加膨化大豆后乳脂中共轭亚油酸（CLA）含量提高了83.33%(P<0.05）。全脂整粒大豆组、混合油籽组以及全脂膨化大豆组乳脂中月桂酸（C12﹕0）和豆蔻酸(C14﹕0)含量分别比对照组降低了35.73%和35.51%、38.65%和23.83%、24.85%和31.48%。【结论】日粮添加植物油籽可以改变乳脂脂肪酸组成，增加CLA含量，降低月桂酸（C12﹕0）和豆蔻酸(C14﹕0)含量，从而提高乳品质。     

紫花苜蓿MsNST的克隆及对木质素与纤维素合成的功能分析

【目的】木质素和纤维素是植物次生细胞壁的主要组成成分,是影响牧草消化率和品质的主要因素之一。紫花苜蓿作为高蛋白饲草,是奶牛等草食家畜优质饲草的主要来源。因此,苜蓿木质素和纤维素合成机制一直是受到关注的研究热点。模式植物拟南芥NAC家族的NST转录因子（NAC secondary wall thicking promoting factor）调控次生细胞壁的合成,但紫花苜蓿NST的功能与调控机制尚不明确。本研究通过分析紫花苜蓿NST的表达模式,及在拟南芥与苜蓿中过表达揭示其对木质素和纤维素合成的影响。【方法】通过同源克隆获得MsNST CDs序列,并对该基因进行生物信息学分析。利用qRT-PCR检测该基因受赤霉素（GA3）,水杨酸（SA）和多效唑（PCB）诱导后的表达模式。通过转基因植株中过表达MsNST,研究其对木质素和纤维素含量及其合成相关基因的影响。【结果】克隆MsNST 的CDs序列,最大开放阅读框为945bp,编码314个氨基酸。生物信息学分析表明,MsNST主要由无规则卷曲组成（60.83 %）;三级结构预测显示,MsNST以同源二聚体的形式有效的促进蛋白质间的相互作用。进化树分析表明,单子叶和双子叶分为两个分枝,暗示存在一定程度的进化,而MsNST与蒺藜苜蓿和大豆的NST属于双子叶植物分枝中的亚分枝,表明豆科植物间亲缘关系较近。MsNST与拟南芥NST1-3的氨基酸序列相似性较高（49%—55.9%）,并含有NAC转录因子的5个保守结构域。qRT-PCR分析表明,MsNST受GA3、SA和PCB的诱导表达,相对表达水平（12h）分别是对照的2.19、3.67和3.65倍。过表达MsNST导致拟南芥下胚轴缩短,转基因拟南芥半矮化,花序茎束间细胞壁纤维增厚,细胞壁结晶纤维素（13%）、总糖（7%）和木质素（11.7%）含量增加。通过分析木质素和纤维素合成相关基因表达水平发现,拟南芥和苜蓿中过表达MsNST均能激活木质素合成关键基因（PAL,4CL等）及纤维素合酶复合体亚基CesA家族基因的表达。【结论】MsNST受外源激素GA3、SA和PCB诱导表达。转基因植物中过表达MsNST可激活次生壁木质素和纤维素合成相关基因的表达,同时茎束间纤维细胞壁增厚,细胞壁结晶纤维素、总糖和木质素含量增加,暗示MsNST对次生细胞壁木质素和纤维素的合成有重要的调节作用。     

转Bt Cry1Ac基因抗虫棉花外源基因漂移研究

【目的】研究转Bt Cry1Ac基因棉花外源基因漂移规律,为转基因棉花生态安全性评价提供依据。【方法】2014年在吐鲁番市和2015年在库尔勒市,利用小区试验种植转基因棉花,翌年利用卡那霉素抗性检测结合分子检测的方法检测外源基因的漂移。【结果】在距离转基因棉花小区边缘1~120 m均能检测到含有外源基因Cry1Ac。SGK321种子漂移率最大漂移率是向南方向距离转基因棉花小区边缘1 m处,漂移率为5 %;GK19最大漂移率是向西方向达到了10.09 %。以方向因素和距离因素建立Cry1Ac基因漂移Logistic回归预测模型,方向和距离对种子漂移都有显著影响(P <0.05),但方向和距离两个因子并不能最终决定外源基因的漂移率。【结论】转基因棉花外源基因漂移率受方向和距离的影响,但最终决定外源基因的漂移率,并不是方向和距离联合作用的结果。     

大豆根特异性GmPR1-9启动子的鉴定及其在根腐病抗性中的应用

【目的】 鉴定大豆根特异性启动子及其最小调控片段,并利用启动子工程技术构建时空特异人工启动子并评价其在根腐病抗性中的应用价值,为大豆抗疫霉根腐病的遗传改良提供遗传元件。【方法】 通过分析大豆根、茎和叶片转录组数据,筛选在根中特异高水平表达的基因,克隆获得其启动子序列。根据顺式元件的分布位置构建截短载体,并驱动GUS报告基因在大豆发状根组织中超表达,筛选控制根特异性表达的核心片段。将获得的核心启动子片段与疫霉菌诱导启动子元件p4XD串联构建人工启动子驱动疫霉抗性相关基因GmNDR1在大豆发状根中超表达,分析转基因组织对疫霉菌抗性水平及目的基因在病原菌侵染过程中的表达水平。利用转基因本氏烟草从整株水平评价转基因材料对疫霉菌的抗性水平。【结果】 通过筛选发现6个大豆根特异性表达的PR1同源基因,其中,pGmPR1-9具有最高的启动子表达活性。PLACE在线预测发现其启动子区域含有大量的根特异表达相关顺式元件。对pGmPR1-9启动子进行截短试验,发现5′端截短片段L1、L2、L3、L4和L5均具有启动GUS表达活性,长度为166 bp的L5（-166—-1）片段具有全长启动子80%的活性,并可驱动GUS在转基因烟草根中特异表达;3个3′端截短片段R1、R2、R3和1个双端截短片段M1几乎检测不到GUS酶活性。p4XD-L5融合片段驱动GmNDR1在大豆发状根中超表达后可显著提高大豆发状根对疫霉菌的抗性,超表达发状根接种病原菌后发病程度和病斑长度显著低于对照,疫霉菌丝积累量在接种48 h时减少66.5%。GmNDR1在超表达组织中始终维持在高表达水平,在接种前,表达量是对照组织的39.2倍,接种后,表达量受疫霉菌侵染诱导进一步上调,并在36 h达到最高。GmNDR1在p4XD-L5::NDR1转基因本氏烟草根中的表达量显著高于茎和叶片,表现出明显的根部表达偏好性。超表达株系接种辣椒疫霉菌15 d后的株高、根长和鲜重显著高于对照,同时叶片萎蔫率和病斑长度显著低于对照植株。【结论】 鉴定获得一个大豆根特异性表达启动子及其核心序列,融合诱导性和组织特异性启动子核心元件的人工启动子p4XD-L5驱动抗性基因GmNDR1超表达,可显著增强转基因大豆发状根和本氏烟草对疫霉菌的抗病性。     

紫花苜蓿MsSQE1的克隆及对皂甙合成的功能分析

【目的】鲨烯环氧酶（squalene epoxidases,SQE）是苜蓿皂甙合成途径中的一种限速酶,与苜蓿皂甙的合成密切相关。通过对苜蓿鲨烯环氧酶（MsSQE1）基因的克隆及在苜蓿中过表达,探究鲨烯环氧酶对皂甙合成的作用机制。【方法】以模式植物蒺藜苜蓿鲨烯环氧酶基因序列设计引物,同源克隆苜蓿MsSQE1。对MsSQE1进行生物信息学分析;通过基因枪轰击技术,使MsSQE1在洋葱表皮瞬时表达,进行亚细胞定位。利用qRT-PCR方法分析该基因在根、茎、叶中的表达水平,以及在紫外辐射、ABA和GA₃条件下的表达模式。在茉莉酸甲酯（MeJA）的诱导下,分析MsSQE1的转录水平,及对苜蓿皂甙含量的影响。利用根癌农杆菌转化体系,获得过表达MsSQE1的阳性转基因植株,并测定转基因植株的皂甙含量。【结果】克隆了MsSQE1的cDNA序列,开放阅读框1 578 bp,编码525个氨基酸,等电点为8.59。同源性比对分析,其氨基酸序列与蒺藜苜蓿中SQE1氨基酸序列同源性为98.6%,与拟南芥的同源性为80%。亚细胞定位显示,MsSQE1可能定位于细胞膜。组织特异性表达分析显示,MsSQE1在叶中的表达量最高,茎中次之,根中的表达量最低。在紫外辐射、ABA和GA₃的诱导表达显示,紫外辐射诱导24 h,叶中表达量最高; GA₃（50 μmol·L ^-1）和 ABA（100 μmol·L ^-1）处理,均为8 h叶中表达量最高;MeJA处理能诱导MsSQE1表达量上调的同时苜蓿总皂甙含量也随着MsSQE1表达的上调而增加。分析过表达MsSQE1转基因苜蓿和转空载体苜蓿株系发现,MsSQE1的表达水平和总皂甙含量均升高,其中MsSQE1的表达水平是对照的3.11—9.45倍,总皂甙含量比对照提高14.26%—28.05%,暗示MsSQE1是苜蓿皂甙合成途径中的一种关键调节酶。【结论】从豆科牧草紫花苜蓿中克隆了MsSQE1并进行功能分析。在苜蓿中过表达MsSQE1能增加苜蓿总皂甙含量,暗示MsSQE1的表达影响苜蓿皂甙的生物合成,可能对皂甙的合成有重要的调节作用。     

转水稻条纹病毒NS3本氏烟的抗病性

【目的】NS3编码的蛋白是水稻条纹病毒（Rice stripe virus,RSV）RNA沉默抑制子。笔者前期研究发现,转NS3本氏烟（Nicotiana benthamiana）对RSV有一定的抗性。为深入揭示NS3在寄主体内的作用机制,本文将进一步探究转NS3本氏烟对其他烟草病害的抗性。【方法】以野生型本氏烟和转NS3本氏烟为试验材料,通过农杆菌浸润法接种马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）侵染性克隆,观察病毒症状,抽提系统发病叶片总RNA,并利用RT-qPCR方法检测病毒的相对积累量;采用灌根接种法分别接种烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）,观察植株表型并统计发病率和病情指数。【结果】PVX侵染本氏烟后,植株叶片主要表现为花叶、褪绿等症状,NS3表达植株与野生型植株具有相同的PVX症状表现。在接种PVX 10 d后,RT-qPCR检测发现与野生型植株病毒积累量相比,NS3表达抑制了PVX在本氏烟体内的积累水平,两个转NS3株系（NS3-6、NS3-9）中PVX的相对积累量分别为野生型植株的68.17%和81.01%。青枯病菌在野生型植株和转基因植株上均引起萎蔫、猝倒等典型的病害症状,且两者的症状无明显差异。在青枯病菌侵染早期,NS3表达在一定程度上利于病菌的侵染,表现出对青枯病较为敏感;而在接种14 d,野生型植株的发病率为100.00%,病情指数为78.67,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为95.00％、98.33％,病情指数分别为70.00、73.00;14 d之后发病率和病情指数逐渐升高,而NS3表达株系的病情指数均低于野生型植株。黑胫病菌在野生型植株和转基因植株上均为在茎基部出现黑褐色坏死斑等典型病害症状,且NS3表达也不影响本氏烟的症状表现。在黑胫病菌的侵染初期,NS3-6株系的发病率高于野生型植株;但在整个黑胫病发生过程中,转NS3株系的病情指数均低于野生型植株,在接种12 d,野生型本氏烟的发病率为96.67％,病情指数为77.50,而NS3-6、NS3-9株系的发病率分别为90.00％、86.67％,病情指数分别为64.17、62.08。【结论】通过病原侵染过程观察表明NS3表达在一定程度上影响了烟草病害在本氏烟上的侵染和严重程度,且对不同病原菌的影响不同。     

不同油料籽实对奶牛瘤胃液、血浆脂肪酸组成及乳脂CLA含量的影响

 【目的】研究不同脂肪酸构成的油料籽实对奶牛瘤胃液和血浆中脂肪酸的组成及乳脂CLA含量的影响,初步探讨乳脂CLA合成机制,为改善牛奶脂肪酸构成,提高乳脂中CLA含量寻找合适途径。【方法】以3头装有永久性瘤胃瘘管的经产荷斯坦奶牛为试验动物,采用3×3拉丁方设计,在日粮中添加不同油料籽实（葵花籽、亚麻籽、菜籽）,3种日粮的粗脂肪含量基本相同,测定采食后不同时间点瘤胃液、血浆及乳脂中脂肪酸含量。【结果】葵花籽组奶牛乳脂中CLA、t11-C18﹕1、PUFA及LCFA比例均显著高于菜籽组和亚麻籽组（P＜0.05）;葵花籽组奶牛血浆中t11-C18﹕1的比例显著高于菜籽组和亚麻籽组（P＜0.05）;瘤胃液中各种脂肪酸含量在3组之间差异不显著（P＞0.05）,随采食后时间的延长,饱和脂肪酸含量逐渐增加,不饱和脂肪酸含量逐渐减少,不同时间点瘤胃液中CLA的比例均较低;瘤胃液、血浆中的t11-C18﹕1含量对乳脂中CLA含量的决定系数（R2）分别为0.841和0.766。【结论】富含亚油酸的葵花籽在优化奶牛乳脂肪酸构成、提高CLA含量方面效果最好。     

Functional Characterization of a UDP: Flavonoid Glycosyltransferase Gene UGT73C19 in Glycine max

【Background】 Flavonoids are a group of important plant secondary metabolites accumulate in soybean, which are involved in many physiological activities, including soybean growth, development and stress resistance. Glycosylation catalyzed by UDP-glycosyltransferase is a key step in flavonoid biosynthesis. 【Objective】 The objective of the present study is to investigate the in vitro enzymatic activity and in vivo function of a soybean glycosyltransferase protein encoded by the UGT73C19 gene, the achievement of which will deep our understanding on the mechanism of the flavonoid biosynthesis in soybean. This study will provide gene resource and theoretical basis for the genetic modification in soybean. 【Method】 Flavonoids in the leaves of soybean core germplasm resources were detected by HPLC, and the expression level of UGT genes were detected by qRT-PCR. The coding region of the UGT73C19 gene was cloned from cDNA of soybean leaf (Williams 82). The amino acid sequences of UGT73C19 were searched in the NCBI database, and the software MEGA5 and DNAMAN were used for multiple sequence alignment and the construction of a phylogenetic tree. The recombinant UGT73C19 protein was expressed in E. coli and its enzymatic activity was determined towards various flavonoid aglycones. All the enzymatic products were identified by HPLC-MS. The expression profile of the UGT73C19 gene in soybean was analyzed by qRT-PCR. UGT73C19 was over-expressed in Arabidopsis thaliana by floral dipping method. Flavonoid content and composition were determined in seedlings and seeds in homozygous lines that showed the relatively high UGT73C19 expression level. 【Result】 Flavonoids in the leaves of soybean core germplasm showed significant differences in flavonoid composition and content in different varieties. Soybean core germplasm can be divided into 12 different types according to flavonoid composition. There was a positive correlation between the content of flavonoids and the expression level of UGT73C19 gene in the leaves of soybean core germplasm resources. The coding sequence of UGT73C19 gene was cloned,and the coding region was found to be 1482 bp, encoding a protein of 493 amino acids. The deduced UGT73C19 protein was found to have a conserved PSPG domain at the C-terminal. In vitro enzymatic activity analysis revealed that the recombinant UGT73C19 protein exhibited glycosyltransferase activity toward six flavonoid aglycones (kaempferol, quercetin, myricetin, apigenin, daidzein and genistein), and it showed the highest catalytic efficiency toward quercetin. The glycosylation sites were at the 5 and 7 hydroxy groups of flavonoid substrates, and the glycosylation substrates and sites of the recombinant UGT73C19 protein showed high diversity. It was found that the total flavonoid contents in the seedlings and seeds of the transgenic A. thaliana increased significantly, by 49% to 70% in leaves and 34% to 37% in seeds, in particular quercetin 3-O rhamnose in the seeds. 【Conclusion】 The recombinant UGT73C19 protein can catalyze the glycosylation of a group of flavonoid compounds and over-expression of UGT73C19 gene can increase the content of flavonols in plants like A. thaliana.     

填饲鹅肝脏组织中脂肪酸沉积与FAS基因mRNA的表达丰度

【目的】研究不同填饲期肥肝鹅肝脏组织中不同脂肪酸沉积与脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase,FAS）基因mRNA的表达丰度及相关性。【方法】对200只100日龄青农灰鹅进行填饲,从填饲0 d起,每隔6 d屠宰1次,共6次。每次随机选取10只,每只为1个重复,屠宰测定肥肝重、肝中脂肪含量、各种脂肪酸含量和FAS基因mRNA的表达丰度。【结果】①肥肝重随填饲时间的延长而增加,肝中粗脂肪含量（ether extract,EE）随肝重的增加而增加,以填饲18-24 d鹅的肥肝增重最快（504.67 g/6 d）,12-18 d的次之。②肝中饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）和单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）的含量随着填饲时间的延长而增加,尤其是在12-18和18-24 d这两个阶段的沉积最为明显,而多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid,PUFA）主要是在填饲后期（18-30 d）沉积;在整个填饲过程中,各种脂肪酸的沉积表现为填饲后期显著大于填饲前期（P＜0.05或P＜0.01）;填饲30 d时沉积量较大的脂肪酸为肉豆蔻酸（C14﹕0）、棕榈酸（C16﹕0）、硬脂酸（C18﹕0）、棕榈油酸（C16﹕1）、油酸（C18﹕1）、二十碳烯酸（C20﹕1）和亚油酸（C18﹕2）,每100 g组织中的含量分别为0.6028 、17.72、7.25、2.75、37.42、0.3078和0.43 g。③FAS基因mRNA的表达丰度随肝脏增重和脂肪沉积速度的增加呈现出先增加后迅速降低的趋势,填饲24 d时极显著高于其它时期（P＜0.01）;0-24 d鹅肝脏组织中FAS基因mRNA表达丰度与肥肝重、EE、SFA和MUFA存在极显著正相关（P＜0.01）,而与PUFA存在弱负相关且差异不显著（P＞0.05）,30 d时相关性不显著（P＞0.05）。【结论】①鹅肝中EE、SFA和MUFA的含量随填饲时间和肝重的增加而增加;填饲18-24 d鹅肝脏增重和EE、SFA和MUFA的沉积速度最快;②FAS基因mRNA的表达对肥肝鹅肝脏中脂肪的沉积具有填饲前、中期快速增加,填饲后期下降的调控作用。     

不同菌种发酵对藜麦蛋白质特性及脂质构成的影响

【目的】 比较不同菌种发酵对藜麦蛋白质水解及脂质变化的影响,为藜麦发酵食品的开发提供理论参考。【方法】 以藜麦为原料,加入不同菌种（酵母菌、植物乳杆菌及其混合菌）进行发酵,通过测定蛋白水解指数、蛋白质各组分、游离氨基酸、游离脂肪酸及脂质构成来判定发酵效果,确认哪种微生物更有利于藜麦营养成分的转化。【结果】 经酵母、植物乳杆菌、酵母和植物乳杆菌混合菌发酵后,藜麦蛋白质水解指数均有所升高,且主要是清蛋白和球蛋白发生了水解。发酵后藜麦中的游离氨基酸含量增加显著,尤其是必需氨基酸。酵母发酵藜麦更有利于蛋白质、多肽等水解成氨基酸。通过发酵处理,藜麦中的游离脂肪酸含量显著增加,且饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的比例更为接近1﹕1﹕1;甘油三酯、甘油二酯含量降低,但磷脂等功能脂的含量有所提高,且有酵母菌参与更有利于上述转化。【结论】 酵母菌、植物乳杆菌发酵过程中主要水解藜麦清蛋白和球蛋白成氨基酸等小分子化合物,且游离必需氨基酸含量显著升高;两种菌发酵后都有利于增加游离脂肪酸含量,降低甘油三酯、甘油二酯含量,且提高磷脂的含量。经酵母发酵,更有利于改善藜麦营养。     

PEG-6000和NaCl胁迫对转GbWRKY32基因烟草种子萌发及苗期生长的影响

【目的】研究GbWRKY32基因的抗旱及耐盐功能。【方法】以转GbWRKY32基因烟草以及本生烟草为材料,研究在不同浓度PEG-6000(0%、5%、10%、15%)以及不同浓度NaCl(0 mm、100 mm、150 mm、200 mm)处理下,对转GbWRKY32基因烟草种子萌发、全苗长、根系以及干重、鲜重的影响。【结果】(1)随着PEG-6000浓度的不断增加转GbWRKY32基因烟草种子与本生烟草种子萌发率全苗长、根系以及干重、鲜重不断降低;(2)在PEG-6000浓度达到15%处理14 d后,三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子萌发率、全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子;(3)随着NaCl浓度的不断上升,其整体趋势与PEG胁迫相同;在NaCl浓度达到150 mm时,处理14 d以后三个转GbWRKY32基因烟草株系的种子萌发率、全苗长、根系以及干重、鲜重明显高于本生烟草种子;【结论】GbWRKY32基因转入烟草中可以明显提高烟草对干旱以及盐胁迫的抵御能力。     

抗草甘膦转基因大豆（Glycine mac (L.) Merri）杂草性评价的试验实例

 【目的】评价美国孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆40-3-2作为加工原料引入中国可能带来的演化为杂草的生态风险,验证转基因大豆杂草化环境安全评价条款的可操作性。【方法】在农田生态环境下比较了抗性大豆、受体品种和当地常规品种的生存竞争能力、繁育能力、自生苗、种子落粒性和延续能力。【结果】在适宜季节种植的转基因大豆的生存竞争能力和繁育能力明显低于当地常规品种,表现在复叶数少、植株较矮、结实率低;受体品种的生存竞争能力和常规品种相似,但繁育能力低于常规品种。在非适宜季节三者的生存竞争能力相似,而受体品种和抗性大豆的结实能力都比常规品种略强。3个品种的落粒性都不强,形成自生苗的可能性也都很小。所有供试大豆种子的延续能力都很弱。【结论】以上研究结果表明美国孟山都公司生产的抗草甘膦转基因大豆40-3-2在中国南京地区环境条件下演化为杂草的可能性较小,其作为加工原料进口后演化为杂草的生态风险小。试验证实了转基因大豆环境安全评价标准的杂草性条款具有可操作性。     

中国荷斯坦牛SCD1外显子5基因多态性及其对乳中脂肪酸组成的影响

【目的】探讨中国南方地区荷斯坦牛SCD1基因外显子5遗传多态性及其对乳中不饱和脂肪酸含量及其不饱和指数的影响。【方法】以扬州大学实验农牧场323头中国荷斯坦牛为试验材料,采用PCR-SSCP法对SCD1基因外显子5的3个位点遗传多态性进行分析,同时挑选140头体况相近（BCS=3.0±0.5）、无临床乳房炎、胎次在2-3胎、处于泌乳中后期（产奶100-300 d）的中国荷斯坦牛,取全天混合奶样（早﹕中﹕晚=4﹕3﹕3）100 mL用于测定脂肪酸含量,进而分析多态性对乳中脂肪酸成分的影响。【结果】SCD1-702位点无多态,SCD1-762和SCD1-878分别发现T/C和C/T两个突变。SCD1-762位点A为优势等位基因,基因频率为0.7897。SCD1-878位点C为优势基因,频率为0.7835。χ2检验表明该群体的中国荷斯坦奶牛在SCD1基因的这两个位点都处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。SCD1-762与SCD1-878处于极显著连锁不平衡,连锁不平衡系数r2为0.879,达到极显著水平（P＜0.01）。SCD1-762和SCD1-878两位点共组成4种单倍型：AC、BC、AT、BT。SCD1-762、SCD1-878及其单倍型对MUFA比例及总不饱和指数的影响均达到显著水平（P＜0.05）,即SCD1 878位点TT型乳中MUFA比例及总不饱和脂肪酸指数显著低于CC和CT型,而SFA比例显著高于CC和CT型（P＜0.05）;SCD1 762位点BB型乳中MUFA比例及总不饱和脂肪酸指数显著低于AA和AB型（P＜0.05）。单位型AC型MUFA比例及总不饱和指数显高于BT型,而SFA比例显著低于BT型（P＜0.05）。【结论】SCD1 878和762位点突变对乳中乳脂肪酸组成及饱和指数有显著的遗传效应,可作为影响中国荷斯坦奶牛乳脂肪酸组成的重要候选基因。     

芝麻硬脂酸脱饱和酶基因SiSAD的克隆及功能验证

【目的】对芝麻△9硬脂酰-ACP脱饱和酶基因SiSAD（△9 stearoyl acyl-carrier-protein desaturase）进行克隆与表达分析,并转入拟南芥,探究其在油酸合成过程中的作用,为芝麻油酸含量的遗传改良提供分子基础。【方法】提取中芝13叶片的总RNA,反转录为cDNA。根据芝麻基因组数据库中的SiSAD序列信息（序列号为SIN_1008977）设计引物,以cDNA为模板,通过RT-PCR克隆获得SiSAD编码区序列,并与参考基因组序列进行比较。利用InterPro进行保守结构域分析,获得SiSAD蛋白的保守结构域。利用BLAST对SiSAD蛋白进行同源对比,获得SiSAD的同源蛋白质。采用邻接法构建系统进化树,获得芝麻SAD蛋白与橄榄、牵牛花、蓖麻、莴苣、葡萄、柑橘、拟南芥等植物SAD蛋白的亲缘关系。通过荧光定量PCR检测SiSAD在2个芝麻品种中芝33和中丰芝一号的根、茎、叶、蕾和种子中的相对表达量,分析SiSAD的表达特异性。将SiSAD连接过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型拟南芥（Col-0）,筛选阳性后代,对T₃代转基因和野生型的拟南芥种子中硬脂酸和油酸相对含量进行测定,分析SiSAD的功能。【结果】成功获得SiSAD的编码区序列,与参考基因组序列一致,全长为1 152 bp,编码383个氨基酸,SiSAD蛋白的分子量为43 kD,等电点为6.18。发现SiSAD蛋白含有一个保守结构域,属于脂肪酸去饱和酶家族成员,与其他植物的SAD蛋白质序列的同源性较高,暗示SiSAD在不同物种中的功能可能比较保守。系统进化分析显示,芝麻SAD蛋白与牵牛花和橄榄的SAD蛋白处于同一分支,进化关系较近,与蓖麻、拟南芥、柑橘的SAD蛋白亲缘关系较远。荧光定量PCR结果表明,SiSAD在芝麻种子中的表达量远远高于其他组织,有显著的组织特异性。成功构建了SiSAD的过表达载体,通过农杆菌介导法转化拟南芥,结果表明SiSAD成功导入拟南芥中,而且转录水平很高。对T₃代转基因拟南芥种子中硬脂酸和油酸的相对含量分析表明,与野生型拟南芥比较,3个转SiSAD拟南芥株系中硬脂酸（C18:0）含量分别降低了3.0%、4.8%和6.1%,而油酸（C18:1）含量分别升高了2.8%、4.3%和7.8%,平均升高4.97%。【结论】克隆获得芝麻SiSAD的全长cDNA序列,鉴定了SiSAD的功能,发现SiSAD在油酸合成代谢过程中正向增加油酸含量,可应用于高油酸芝麻新品种培育。