茉莉酸羧基甲基转移酶基因的克隆及其高效表达载体的构建

以拟南芥花为材料,应用RT-PCR方法克隆拟南芥茉莉酸甲酯合成途径中重要的限速酶--茉莉酸羧基甲基转移酶基因,并进行生物信息学分析,以pCAMBIA1304+为基本载体构建其植物高效表达载体pCAM-BIA1304-AtJMT克隆到的AtJMT编码区序列为1 170 bp,编码389个氨基酸的多肽.生物信息学分析该蛋白理论分子量为43.37 kD,等电点为5.18.三级结构预测表明其具有典型的羧基甲基转移酶蛋白功能域甲基供体的结合位点,蛋白质三维模型具有典型的甲基转移酶的蛋白立体结构.获得的工程菌可用于遗传转化长春花等,为萜类吲哚生物碱代谢工程新型策略奠定基础.

Abstract：

Jasmonic acid carboxyl methyltransferase (JMT) is one of the most important key enzymes involved in the biosynthetic pathway of methyl jasmonate (MeJA) in Arabidopsis thaliana. The JMT gene of A. thaliana (AtJMT) was isolated through RT-PCR with a pair of specific primers that were designed according to the sequences of the JMT reported. We characterized it by bioinformatic analysis and constructed its over-expression vector. The computational analysis of the coding sequence showed that it had 1170 bp nucleic acids, encoding 389 amino acids (aa) polypeptide with a predicted molecular weight of 43. 37kD and an isoelectric point of 5.18. Bioinformatic analysis demonstrated that AtJMT contained the typical functional domains of JMT, methyl donor binding sites. The 3-D structure of AtJMT had the typical structure of known methyltransferase protein. The engineered bacteria can be used to genetically transform Catharanthus roseus, to promote the bioaccumulation of TIAS. The cloning, characterization and construction of plant expression vector will be a fundamental work to facilitate new strategies of the metabolic engineering of TIAS.     

茶树类黄酮O-甲基转移酶基因的克隆及原核表达分析

【目的】克隆茶树（Camellia sinensis） 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。     

茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及原核表达

以从茶树叶子中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR利用RACE技术,得到咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,COMT)基因全长1 381bp,其开放阅读框为1 092bp,编码393个氨基酸,推测的蛋白分子量约为39.661 9ku,理论等电点为5.66,在GenBank的登录号为HM204933。其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因达100%。将该基因重组到表达载体pET-32a(+)中进行原核表达,经IPTG诱导,SDS-PAGE检测结果表明茶树COMT基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,电泳检测到一条大约60ku的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量相符。     

甲基茉莉酸和草酸诱导油菜BN10基因的表达

利用实时荧光定量PCR方法,观察油菜BN10基因在根、茎、叶中的表达差异,并分析甲基茉莉酸(MeJA)和草酸(OA)对该基因的诱导表达的动态变化。结果表明:BN10基因在油菜根、茎、叶中均能表达,其中在根中的表达量最高,茎中的表达量次之,在叶中的表达量最低,且在抗病毒品种苏油1号中的表达量高于感病品种中双9号;BN10的表达受MeJA和OA的诱导影响。MeJA诱导处理感病品种中双9号叶片后,BN10基因表达先升后降,在24h时表达量最高,为诱导前的2.58倍,之后有所下降,但诱导后的表达量始终高于诱导前,72h时的表达量仍为诱导前的1.13倍;OA诱导处理中双9号后,BN10表达量也是先增加后降低,在12h时达到最大值,为诱导前的2.5倍,72h时下降至最低,仅为诱导前的25%。MeJA诱导处理抗病品种苏油1号后,BN10的表达趋势与中双9号相似,但各时间点的表达量均高于中双9号;OA诱导处理苏油1号后,对BN10的诱导更强烈,表达量在6h时即达到峰值,为诱导处理前的3.05倍,之后逐渐下降。     

贮藏花生种子茉莉酸甲酯处理与黄曲霉污染关系的研究

以花生(Arachis hypogaea L．)汕油523、粤油79、湛油30为试验材料，在干燥器中分别用LiCl、MgCl2饱和溶液使隔层储存的种子的含水量(质量分数)分别降至2．82％、4．96％，用1mmol／L的茉莉酸甲酯处理后开放式贮存3个月，接种黄曲霉孢子并测定蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor，PI)、脂肪氧化酶(1ipoxygenase，LOX)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)的活性。结果表明茉莉酸甲酯处理后提高了PI、LOX和PAL活性．不同含水量有相似的结果．     

外源茉莉酸甲酯对灵芝多糖及灵芝酸含量的影响

[目的]探寻外源茉莉酸甲酯对灵芝多糖及灵芝酸含量的影响。[方法]用含有不同浓度的茉莉酸甲酯在不同的发酵时间对液体培养基中的灵芝进行诱导培养。[结果]在发酵培养的第4天,添加外源茉莉酸甲酯浓度为50μmol·L~(-1)时,灵芝菌丝体和菌液中灵芝多糖含量最高,菌丝体中灵芝多糖含量为398.98mg·g~(-1),是对照的1.83倍;菌液中的灵芝多糖含量为4.20g·L~(-1),是对照的1.56倍。添加外源茉莉酸甲酯浓度为100μmol·L~(-1)时,灵芝菌丝体及菌液中灵芝酸含量最多,灵芝菌丝体中灵芝酸为50.02 mg·g~(-1),是对照的1.93倍;菌液中灵芝酸含量为7.10mg·L~(-1),是对照的2.21倍。[结论]说明外源茉莉酸甲酯能够有效的促进灵芝多糖和灵芝酸的合成。     

药西瓜UDP-糖基转移酶基因的克隆与表达分析

为明确药西瓜UDP-糖基转移酶催化葫芦素形成葫芦素配糖体的表达规律,以药西瓜品种"WM9"叶片为供试材料,采用RT-PCR技术克隆药西瓜UDP-糖基转移酶基因,并对编码蛋白进行分析。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR),以ACTIN为内参基因,分析获得的2个药西瓜UDP-糖基转移酶基因在不同组织器官中的表达规律。结果表明:克隆得到2个UDP-糖基转移酶基因,分别为1 546 bp和1 559 bp的cDNA全长序列,命名为UDP-E1和UDP-E2。对扩增获得的序列进行生物学信息分析,确定UDP-E1基因的完整开放阅读框(ORF)为1 314 bp,可编码氨基酸437个,理论分子量为49.02 ku,等电点为5.99,属稳定蛋白,Genbank登录号MK576125。UDP-E2基因的ORF为846 bp,可编码氨基酸281个,理论分子量为32.78 ku,等电点为5.23,属不稳定蛋白,Genbank登录号MK576126。这2个基因属于糖基转移酶超家族。UDP-E1和UDP-E2均与香瓜、黄瓜的UDP-糖基转移酶基因序列相似性最高。在各组织器官中,UDP-糖基转移酶均有表达,且在茎中表达水平最低,叶中表达水平最高。     

外源茉莉酸甲酯缓解盐对水稻种子萌发的抑制作用

在100 mmol/L NaC l胁迫下,经蒸馏水吸胀处理的LHN(耐盐)和IR26(盐敏感)水稻种子的发芽势、发芽率和发芽指数均较对照下降,LHN分别下降12.2%、12.5%和3.12,IR26分别下降46.6%、33.6%和9.42,IR26下降的幅度大于LHN.吸胀后,不同质量浓度(2、1、5×10-2、5×10-4和5×10-6mg/L)的外源茉莉酸甲酯(M e-Ja)对LHN和IR26在盐胁迫下发芽势、发芽率和发芽指数影响不同.以相对盐害率判断,质量浓度为2和5×10-6mg/L的Me-Ja对LHN在盐胁迫下萌发的促进作用不显著,质量浓度为5×10-2和5×10-4mg/L的M e-Ja表现为促进作用,质量浓度为5×10-2mg/L的M e-Ja促进作用最大;而对于IR26在盐胁迫下的萌发,5种质量浓度的M e-Ja的都具有显著的促进作用,且质量浓度为5×10-4mg/L的促进作用最大.     

家蚕保幼激素甲基转移酶基因的克隆与表达分析

根据家蚕表达序列标签(ESTs),克隆了一个家蚕保幼激素甲基转移酶基因(JHAMT2)的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因全长1007 bp,序列分析有4个外显子,定位于家蚕第12号染色体的nscaf 2 993上,推导的编码蛋白序列长度为266AA,有一个甲基转移酶超家族功能位点,与烟草天蛾(Manduca sexta)JHAMT同源性达到38%。JHAMT2基因在家蚕丝腺、特别是中部丝腺组织特异表达,发育时期表现为4龄期有比较高的表达量,5龄期只在5龄第3日有表达,性别差异表现为雄性体内持续表达时间比雌性中长。JHAMT2基因表达受到外源激素MH的负调控和JHA的正调控,雌性对外源昆虫激素的感受更敏感。     

紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与表达

为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(PerC4H)的全长cDNA序列(GenBank登录号:KM434189).PerC4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸残基,还含有长度为21 bp的5’非编码区(5'UTR)和95 bp的3 '非编码区(3'UTR).系统进化树分析得到PerC4H基因与唇形科植物丹参和黄芩的亲缘性最近.由实时荧光定量PCR分析可知,该基因在紫苏中具有组织表达特异性,根中的表达最高,茎中次之,而叶中最少.一定浓度的赤霉素与茉莉酸甲酯能提高PerC4H的表达量,而脱落酸和黑暗处理能降低PerC4H的表达量.     

紫苏RAS基因启动子的克隆及序列分析

迷迭香酸合成酶(Rosmarinic acid synthase,RAS)是紫苏(Perilla frutescens)迷迭香酸生物合成途径中的关键酶,采用基因组步移方法,克隆得到长度为2 022 bp的紫苏RAS基因5′端的启动子片段,并对启动子序列的转录起始位点和顺式作用元件进行分析。结果表明,紫苏RAS基因启动子调控区域除了含有基本的TATA-box和CAAT-box元件外,还含有多个与植物胁迫和生长相关的顺式作用元件,如脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应的顺式作用元件等,另外还包含多个光响应顺式作用元件。     

紫苏叶提取物活性成分测定分析

[目的]研究紫苏叶活性成分含量.[方法]采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定紫苏叶提取物粉总黄酮含量;采用苯酚-硫酸比色法测定紫苏叶提取物粉多糖含量.[结果]紫苏叶提取物粉总黄酮含量为32.51％,多糖含量为9.43％.[结论]紫苏叶含多种活性物质,且紫苏叶中总黄酮含量和多糖含量都较高,这为进一步研究紫苏叶中其他活性物质奠定基础,也为紫苏叶产品进一步开发提供科学依据.     

紫苏12个农艺性状与产量的灰色关联分析

应用灰色关联分析法对11份紫苏材料的12个农艺性状与产量的关联度进行了分析.结果表明:12个性状和产量之间的关联度由大到小依次为单株产量、千粒质量、分枝位、二次有效分枝、一级分枝顶穗长、一次有效分枝、株高、顶部第1节间长、茎粗、主花序有效长度、基部第1节间长、主花序有效角果数.因此,紫苏高产育种中应注意单株产量以及大粒型、多分枝、长穗型植株的选育.     

紫苏组织培养与快速繁殖

以栽培紫苏为材料,通过对其离体茎段的组织培养,建立了诱导、分化、增殖、生根等一整套离体快繁体系。研究结果表明,紫苏茎段外植体较好的灭菌方法为:75%酒精30s+0.1%HgCl210min;茎段外植体初代培养的适宜培养基为MS+2mg.L-1 6-BA+0.5mg.L-1 NAA;继代及增殖培养以6-BA 2mg.L-1与NAA0.1mg.L-1配比时效果较好;试管苗生根培养的最适宜培养基是1/2MS基本培养基附加0.2mg.L-1 NAA。     

不同产地紫苏叶HPLC指纹图谱研究

为建立紫苏叶HPLC指纹图谱检测方法,采用HPLC法,以UltimateTMXB-C18（4.6mm×250mm,5μm）为色谱柱,乙腈（A）-0.1%乙酸（B）为流动相进行线性梯度洗脱,在330nm波长下以迷迭香酸为参照物测定了9个不同产地的紫苏叶的指纹图谱,并作相似度比较分析。建立了紫苏叶HPLC指纹图谱共有模式,...     

不同变种及种源紫苏种子油脂肪酸组成及含量比较

采用化学萃取和GC-MS法,对5个变种11个种源地的17个种质的紫苏种子样品开展了种子油含量及其脂肪酸组成和相对含量的比较和分析。GC-MS结果表明,紫苏油中共发现14种脂肪酸,按相对含量高低划分为6种高含量脂肪酸(＞0.8%)和8种低含量脂肪酸(≤0.2%);其中14-甲基-十六烷酸(C17∶0)、十八碳二烯酸(C18∶2n3)、二十三碳酸(C23∶0)3种低含量脂肪酸为首次在紫苏油脂中被报道;高含量脂肪酸中α-亚麻酸的相对含量最高,达51.92%~62.98%;α-亚麻酸、亚油酸与油酸之间存在一定代谢转化相关性。脂肪酸含量外标法计算结果表明,5个变种中白苏变种的含油率和α-亚麻酸含量较高,作为紫苏油生产原料具有一定优势。      

不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对海拔的响应

为紫苏的合理栽培提供理论依据,在贵州选取5个海拔梯度(398~1 391m)试验点种植6个紫苏品种(系)(奇苏1~6号),收获后检测紫苏含油量及主要脂肪酸成分,分析不同海拔高度紫苏含油量及脂肪酸成分变化。结果表明:不同品种(系)紫苏含油量及脂肪酸成分对不同海拔试验点的响应不同,奇苏1号在镇宁县(海拔1 391m)、开阳县(615m)、思南县(398m)和福泉市(821m)以及奇苏4号在开阳县试验点含油量较高,平均含油量47.27%;奇苏4号在开阳县、湄潭县(海拔802m)、思南县和镇宁县以及奇苏3号在开阳县种植的α-亚麻酸含量较高,平均含量为65.03%;奇苏1号、奇苏2号、奇苏4号和奇苏6号在镇宁县种植及奇苏3号和奇苏5号在福泉市种植的籽粒不饱和脂肪酸含量较高。以含油量为目标性状,奇苏1号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;若以亚麻酸含量为目标性状,奇苏4号含量较高,适宜贵州省内不同海拔点种植;以不饱和脂肪酸为目标性状,偏高海拔地区种植紫苏其籽粒不饱和脂肪酸含量较高。     

紫苏子叶组织培养植株再生的研究

[目的]以紫苏无菌苗子叶为外植体研究紫苏芽再生频率。[方法]在MS培养基中添加不同浓度配比的6-BA和IAA,给予不同黑暗培养时间2、4,-D浓度和预培养时间,研究各因素对紫苏芽苗分化的影响。[结果]子叶在分化培养基MS＋1.0 mg/L 6-BA＋1.5mg/L IAA中培养可获得高达80.01%的再生频率0,.10 mg/L 24,-D的分化培养基预培养3 d,黑暗培养12 d后再转入光照培养效果最好。[结论]该试验可为紫苏的组培繁殖提供参考。