干酪乳杆菌产细菌素的生物学特性分析

[目的]探讨干酪乳杆菌所产细菌素的生物学特征。[方法]对干酪乳杆菌所产的细菌素分别进行抑菌活性、热敏感性、pH范围、蛋白酶敏感性、表面活性剂分析。首先排除过氧化氢、有机酸的干扰,采用牛津杯双层平板法,检测无细胞发酵上清液的抑菌活性。[结果]细菌素对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单核增生李斯特菌具有明显的抑制作用;在pH 3.0~5.5稳定性较好;具有良好的热稳定性;经胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后细菌素失活,表明抑菌成分为蛋白类物质;加入EDTA,抑菌活性明显增强。[结论]干酪乳杆菌所产细菌素是具有良好的热、酸稳定性和较广抗菌谱的蛋白类物质,可为其在防腐保鲜等领域的进一步应用提供科学依据。     

重组干酪乳杆菌代谢产物抑菌效果的研究

试验对重组干酪乳杆菌代谢产物的抑菌效果进行研究。利用牛津杯法研究了干酪乳杆菌代谢产物（不同pH值、热和胃蛋白酶处理）对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果。结果表明乳杆菌的代谢产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有明显抑制作用,在pH值2.0～4.0时有抑菌活性,并且代谢产物对热稳定,其活性不被蛋白酶破坏。结论：重组干酪乳杆菌能产生对肠道致病菌具有抑制作用的代谢产物。     

干酪乳杆菌蛋白酶纯化与动力学性质

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)6033经增菌培养、超声波破碎、冷冻离心后获得粗酶液。粗酶液经硫酸铵分级沉淀后,分别进行阴离子交换层析、疏水层析、分子筛层析,最终获得1种纯蛋白酶。该酶分子量为61 2kD,可被苯甲基磺酰氟(PMSF)和乙二胺四乙酸(EDTA)强烈抑制,Co2 和Ca2 能增强该酶活力,Fe3 、Zn2 和Cu2 对其活性则有抑制作用。该酶在37℃时,最大酶活力出现在pH值7 0附近,pH4 0时相对酶活力下降到39 0%,而pH9 0时相对酶活力仅维持在8 0%左右。pH7 0时该酶的最适温度为37℃左右,20℃时相对酶活力下降到54 0%,而60℃时相对酶活力仅为34 0%。以酪蛋白作为底物时测得该酶Km值为1 5mg/ml、Vmax为32 0。     

抑制变形杆菌的干酪乳杆菌LDJ主要抑菌物质分析

干酪乳杆菌LDJ是一株能抑制变形杆菌生长的优良菌株。为了探究干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液的抑菌效果,采用牛津杯法测定了不同培养时间的无细胞上清液对变形杆菌的抑菌能力,发酵时间在0～4 h时无细胞上清液无抑菌能力,发酵至8 h时抑菌能力逐步上升,发酵时间在24～48 h时无细胞上清液抑菌能力趋于平稳;其中,发酵时间在36 h时,抑菌圈直径最大,为20.48 mm。干酪乳杆菌LDJ无细胞上清液中抑菌物质的理化特性研究结果表明：该抑菌物质对大肠杆菌,金黄色葡萄球菌和李斯特菌都有不同程度的抑制作用;无细胞上清液经40～100℃处理30 min,仍有良好的抑菌活性;pH值在3～6范围内抑菌物质有良好的抑菌效果,在中性及碱性条件下则没有抑菌作用;不同酶处理对无细胞上清液的抑菌效果有不同程度的影响。因此,推测其抑菌有效成分可能为肽类及有机酸。     

高活菌率的干酪乳杆菌微胶囊研究

乳酸菌对环境抗逆性较差,为提高其储存性能,开展了干酪乳杆菌微胶囊化包埋工艺研究。基于透氧率和透湿率测定以及生物相容性试验,对胶囊壁材与辅料进行了筛选评价。采用挤压法分别制备了固芯和多液芯载菌微胶囊,并研究了载菌微胶囊剂在室温下的储存性能和37℃下干燥处理后的残留活菌率。结果表明,微胶囊化处理能够显著提高干酪乳杆菌的储存性能;在植物油储存介质中,载菌微胶囊具有较高的残留活菌率;载菌多液芯微胶囊在37℃下干燥8 h后,残留活菌率为831%,显著高于固芯载菌胶囊。由此,建立了高效“水—油—水”型多液芯干酪乳杆菌微胶囊,在菌活力保持和潜在应用性能方面具有优势。     

干酪乳杆菌NH-2固态发酵基质的选择及优化

[目的]对干酪乳杆菌NH-2固态发酵基质进行筛选及优化。[方法]以麸皮、米糠及豆粕为候选基质,通过基质发酵保湿性、产物活菌数与表面结构的比较,以及后续的复合基质试验,确定干酪乳杆菌NH-2最佳的固态发酵基质。[结果]麸皮与米糠以3：5的比例混合时为干酪乳杆菌NH-2最佳的固态发酵基质,在该条件下产物活菌数最高可达（85.70±2.35）×108cfu/g。[结论]干酪乳杆菌NH-2能以麸皮、米糠为基质通过固态发酵实现其高密度发酵培养。     

干酪乳杆菌表面展示IBDV VP2蛋白

旨在利用pLA载体将IBDV B87株VP2蛋白展示在干酪乳杆菌表面。首先通过RT-PCR扩增VP2基因片段,测序鉴定正确后,将目的片段构建在pLA穿梭质粒上,命名为pLA-VP2,然后将重组质粒电转化到干酪乳杆菌中,构建IBDV重组干酪乳杆菌。应用SDS-PAGE检测重组菌表达目的蛋白VP2,得到约90 kDa的融合蛋白,与预期结果相符。Western blot结果显示VP2蛋白可以与抗IBDV多抗血清发生特异性反应,具有很好反应原性。流式细胞仪的散射光检测器可以捕捉到pLA-VP2重组菌菌体表面的荧光,且重组菌荧光强度强于pLA菌对照组,应用正态分布函数计算pgsA-VP2融合蛋白的表达效率,约为80%。结果表明IBDV VP2蛋白成功展示在干酪乳杆菌表面。     

干酪乳杆菌T1生物特性及保藏方法研究

干酪乳杆菌是一种具有广泛研究价值和良好研究前景的有益微生物。从青藏高原牧区的牦牛酸奶中分离出一株产细菌素的干酪乳杆菌T1(Lactobacillus casei T1)。通过探究菌株基本性质,研究能替代MRS的低成本培养基,筛选冻干保护剂等提高候选生产菌株T1的潜在生产价值。结果显示干酪乳杆菌T1的生长温度区间为20~40℃,耐受的p H值范围为p H2~pH 10。T1菌株对供试革兰阳性细菌和革兰阴性细菌均有较好的抑制作用,对部分供试真菌也有抑制作用,豆粕MRS培养基适应性好。以存活率为指标,进行冻干保护研究的结果表明,供试的4种保护剂的保护效果由大到小依次为乳糖、甘油、甘露醇和抗坏血酸。对候选生产菌株T1生物特性及菌种的保藏研究为该菌的开发打下坚实的理论基础。     

基于响应曲面法的干酪乳杆菌产酸性能研究

利用响应曲面法研究了葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）、葡萄糖（GLC）、接种量以及发酵温度等环境因子对干酪乳杆菌产酸的影响。结果表明,当葡萄糖酸-δ-内酯的添加量为0.848 647%、葡萄糖的添加量为0.366 162%、接种量为8.063 693%和发酵温度31.595 266℃时,干酪乳杆菌产酸量最大,pH值为4.232 400。     

响应面法优化副干酪乳杆菌增菌培养基

采用响应面法优化副干酪乳杆菌增菌培养基。首先利用Plackett-Burman设计法研究了培养基各组分对响应值的影响程度,分析表明蔗糖,酵母膏和硫酸镁对菌体密度的影响显著。然后利用最陡爬坡法逼近最大响应区域。最后在上升最高点处由中心组合试验和响应面分析确定就其最佳含量。结果表明优化后的菌体密度为5.16×109,与预测值5.18×109非常接近,同优化前相比菌体密度提高了一个数量级,副干酪乳杆菌的产量得到显著提高。     

益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性的研究

通过研究益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性作用,为该菌株的安全应用提供依据。连续14 d对小鼠灌胃不同剂量的L.casei Zhang冻干粉,各剂量组小鼠的一般体征、肝脏功能、脏器指数以及肝、肾、脾形态学的观察结果与对照组相比无显著差异（P>0.05）。急性毒性试验及相关指标检测结果显示L.casei Zhang冻干粉无毒副作用。     

干酪乳杆菌胞外多糖的分离纯化及结构分析

[目的]分离纯化干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）胞外多糖,并对其进行初步分析。[方法]使用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱将干酪乳杆菌LC2W产粗多糖分级纯化,并对所得单一组分进行Sepharose CL-6B和高效液相分析。[结果]分离纯化干酪乳杆菌胞外多糖得到3个组分：G1、G2、G3,分别为粗多糖质量的21.33%、33.53%、29.67%,总回收率为84.53%。G1、G2为中性多糖,Sepha-rose CL-6B和高效液相分析表明,其都是均一组分,平均分子量分别为6.65×105、1.01×104Da。[结论]为今后更深入研究乳酸菌产胞外多糖的结构和生物活性等提供参考。     

益生菌Lactobacillus casei|Zhang 高密度发酵中试工艺及动力学研究

在益生菌L.caseiZhang高密度培养小试（3L）基础上,进行30L到150L逐级放大中试生产工艺的研究以确定规模化生产工艺。在优化的发酵工艺下,150L规模发酵菌体密度可达2.9×10^10cfu/mL,与小试水平无差异。采用origin7.5软件在logistic equation基础上建立L.caseiZhang的生长和葡萄糖代谢动力学模型,模型与试验值拟合良好,平均误差小于10%,能够较好地反应发酵过程。初步探讨发酵后菌体的离心和冷冻干燥过程对菌体的影响,虽然发酵液经离心收集菌体后冷冻干燥可得到平均活菌数2.65×10^11cfu/g的菌粉,能够满足益生菌制剂和发酵剂对高活菌数的要求,但冻干前后活菌得率仅49.97%。有必要针对L.casei Zhang的冻干保护剂和冻干工艺进一步优化,以提高菌体存活率得到更高菌体浓度的益生菌粉。     

干酪乳杆菌KLDS1.0381高密度培养条件研究

以麦芽汁培养基为基础培养基,研究干酪乳杆菌生长的碳源、氮源、营养因子及培养条件,通过单因子试验和正交试验确定干酪乳杆菌的最优培养基配方和最佳培养条件,进一步选择菌种的最佳浓缩、富集条件。结果表明,培养基最优配方为麦芽汁培养基中添加1%乳糖、2%胰蛋白胨、20%西红柿汁和0.2%牛肉膏,初始pH 7.0;最适摇瓶装液量为100%。在最适条件下,37℃培养12 h后菌液中活菌数可达到1.37×1010cfu.mL-1。优化浓缩离心富集条件,4℃条件下,4 000 r.min-1离心30 min,离心后菌种存活率为76.27%,浓缩倍数为62.87,干酪乳杆菌高密度培养物中活菌密度可达8.62×1011cfu.g-1。     

L-乳酸生产菌干酪乳杆菌6028液体发酵条件的研究

[目的]寻求干酪乳杆菌6028发酵产酸的最佳条件。[方法]以干酪乳杆菌6028为试验菌种,经斜面培养基、筛选培养基、种子培养基、发酵培养基培养后进行液体发酵,研究碳源、氮源、硫酸镁、磷酸氢二钾、乙酸钠、发酵温度和发酵时间对干酪乳杆菌6028 L-乳酸产量的影响。[结果]当培养基中葡萄糖、氮源、无水乙酸钠、MgSO4.7H2O含量分别为14%、3.75%、0.5%、0.02%,发酵温度为34℃、发酵时间为96 h时,L-乳酸产量最高。在此条件下,L-乳酸的产量达到97.03 g/L。[结论]干酪乳杆菌6028的最佳培养基组成为:葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、无水乙酸钠、MgSO4.7H2O、MnSO4.7H2O、碳酸钙分别为140、15、15、7.5、5、0.2、0.05、100 g/L、吐温-80 1 ml、pH值6.8。最佳发酵时间和温度分别为96 h、34℃。     

干酪乳杆菌作为口服疫苗递呈抗原载体的可行性

通过口服干酪乳杆菌安全性、胃液及胆汁酸耐受能力、肠道定植能力及外源基因在干酪乳杆菌中的遗传稳定性等实验,对干酪乳杆菌作为递呈疫苗抗原活菌载体的可行性进行了研究。结果表明:干酪乳杆菌符合益生菌的标准,可作为递呈疫苗抗原活菌载体。