用于保种的蒙山牛耳成纤维细胞的培养研究

本研究首先利用组织块培养法成功分离培养了蒙山牛耳皮肤成纤维细胞,接着对培养的细胞进行了传代培养和冷冻保存及复苏检测,然后对细胞进行了形态观察和生长曲线测定,最后分别对不同汇合程度和不同保存时问细胞的核型正常率和细胞周期进行分析.结果表明,培养的细胞具有典型的成纤维细胞形态,具有正常的分裂增殖特性,没有转化倾向.在处于S期细胞数目上,60%～70%和80%～90%汇合程度组差异不显著,但显著高于90%～100%汇合程度组(P<0.05).而在处于G_0+G_1期细胞数目上,60%～70%和80%～90%汇合程度组显著低于90%～100%汇合程度组(P<0.05).冷冻保存1个月和3个月组细胞复苏率显著高于12个月组(P<0.05),但保存时间对核型正常率、处于S期细胞数目和处于G_0+G_1.期细胞数目上差异不显著(P>0.05).说明在本实验室条件下,可以利用体细胞培养进行蒙山牛种质资源保存,这也为稀有或濒危物种种质资源保存提供一种有效手段.     

猪耳缘成纤维细胞的体外培养

为了建立猪耳缘成纤维细胞培养体系,为猪核移植实验做准备。主要采用组织块法进行猪耳缘成纤维细胞的培养、传代、冷冻和复苏,观察细胞的形态、生长和贴壁能力。结果显示：组织块培养法培养的细胞,生长较快,呈放射状,体外能正常传代。冷冻和复苏后,细胞能够正常的贴壁、增殖,经胰酶消化后,为核移植实验提供良好的细胞核供体。说明组织块培养方法是简单有效的获得猪耳缘成纤维细胞的方法,获得的细胞可以在体外至少传4代,能够为猪核移植胚胎提供供体细胞。     

脂质体转染陆川猪胎儿成纤维细胞条件的优化

本研究旨在脂质体介导基因转染陆川猪胎儿成纤维细胞时获得较高转染效率,同时以GFP为报告基因探讨影响外缘基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量及细胞与DNA与脂质体复合物的孵育时间。结果表明, 6μgDNA与15μl脂质体转染8h,可获得较满意的转染效率.     

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为了为核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR 鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2-3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR 检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。     

甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞生长和增殖的影响

【研究目的】研究了不同剂量甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核和增殖的影响,在细胞水平上揭示甜菜碱对三黄鸡生长影响的机理,为甜菜碱在动物生产中的应用提供依据。【方法】体外分离培养三黄鸡胚胎成纤维细胞,在培养液中添加不同剂量甜菜碱,观察细胞生长及分裂。【结果】①在基础培养液（DMEM+15%NBS）中添加10mM,20mM甜菜碱对三黄鸡胚胎原代成纤维细胞微核率无显著影响;添加30mM,40mM,50mM甜菜碱显著提高三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的微核率。②在基础培养液（DMEM+15%NBS）中添加10mM、20mM甜菜碱能促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,以在培养液中添加20mM甜菜碱时三黄鸡原代成纤维细胞增殖速度最快。添加50mM甜菜碱时抑制了三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖。【结论】低剂量甜菜碱可促进三黄鸡胚胎原代成纤维细胞的生长和增殖,高剂量甜菜碱对细胞分裂构成危害。     

慢病毒载体介导成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白

试验尝试建立稳定表达外源基因的人成纤维细胞系。取成年男性包皮皮肤的皮下组织,分离培养人皮肤成纤维细胞,分别采用脂质体和慢病毒载体介导转染人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。结果显示,来自成年人包皮皮下组织的成纤维细胞呈梭形,具有快速的增殖和稳定的生长性能。脂质体介导转染的人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白表达不稳定,阳性细胞表达率低,转染后的人成纤维细胞变得更为细长,细胞生长速度降低。慢病毒载体介导人皮肤成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白,转染后细胞生长性能和形态没有变化,经过多次传代和冻存复苏对人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白的表达没有影响,通过流式细胞仪对慢病毒介导表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞检测显示,绿色荧光蛋白表达阳性率为99.85%,并且表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞细胞均一程度为76.05%。试验证实了慢病毒载体能够高效稳定介导人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。     

利用转基因番茄表达人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)

迄今为止，在人类中已经发现了22个成纤维细胞生长因子(FGF)超家族成员。成纤维细胞生长因子不但能够促进包括成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞等多种细胞的增殖，而且还能够促进脂肪细胞的分化，引发巨噬细胞和成纤维细胞产生白细胞介素6(IL-6)，刺激星形细胞的迁移，延长神经元的寿命。FGF在个体的发育、血管发生、造血、肿瘤发生中发挥重要作用，FGF是通过在细胞外与4种FGF酪氨酸受体蛋白激酶相互作用来实现其生物学功能的。人酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)是成纤维细胞生长因子超家族成员。来自于三个胚层的多种细胞都可以表达aFGF。aFGF在治疗帕金森综合症、急性脊柱扭曲性损伤、断指中神经功能重建、脑缺血、肾缺血、心肌梗塞、闭塞性脉管炎、视网膜缺血、胃溃疡及难愈合性伤口等多种临床应用方面具有巨大潜力。为了满足对aFGF这种价格昂贵的细胞因子的需求，本实验探索利用转基因植物表达aFGF。利用转基因植物大规模生产治疗性蛋白是一种非常有潜力的方法，这是因为此种方法安全、生产成本低、易于操作。我们构建的双元表达载体带有一个经过改构的人酸性成纤维细胞生长因子基因(afgf)，载体上的选择标记基因为manA，它使得转化过程中可以使用PMI这种不含抗生素及除草剂的选择系统。利用农杆菌介导的转化方法获得了afgf转基因番茄植物，并且通过PCR-Southern、RT-PCR证明了afgf在宿主基因组中的整合及表达。     

逆转录病毒载体RNAi技术抑制猪瘟病毒在猪胚胎成纤维细胞的增殖

摘要:利用针对猪瘟病毒（Classical swine fever virus , CSFV）石门株Npro基因mRNA的shRNA逆转录病毒表达载体,转导猪胚胎成纤维细胞,在G418的筛选压力下,获得7个稳定整合shRNA表达构件的猪胚胎成纤维细胞株。以100TCID50的CSFV分别感染96孔板内的上述细胞克隆,72h后以对感染细胞克隆的进行间接免疫荧光分析及子代病毒滴度检测,结果显示,在所获得的7个抗性细胞株中,有3株细胞上猪瘟病毒的增殖显著降低,表明所构建的针对猪瘟病毒Npro 基因mRNA的shRNA逆转录病毒整合细胞基因组后转录产生的siRNA可以有效抑制CSFV的复制。     

大肠杆菌感染对绵羊乳腺成纤维细胞损伤及TLR4表达的影响

为研究绵羊大肠杆菌性乳腺炎中乳腺成纤维细胞的损伤情况及TLR4的作用机制,通过体外培养获得原代绵羊乳腺成纤维细胞,大肠杆菌人工感染细胞建立大肠杆菌性乳腺炎细胞模型,分析大肠杆菌对细胞损伤的影响及TLR4在大肠杆菌性乳腺炎中的作用。采用酶消化法结合差速消化法获得原代绵羊乳腺成纤维细胞;MTT法检测细胞活力及TLR4阻断剂CLI-095的细胞毒性作用;乳酸脱氢酶法检测大肠杆菌对绵羊乳腺成纤维细胞的损伤情况并筛选最适MOI比值;qRT-PCR法检测caspase-3、TLR4的mRNA相对表达量及CLI-095的阻断效果;比色法检测细胞焦亡蛋白caspase-4,5的酶活性;WB检测TLR4蛋白的相对表达量;平板活菌计数法检测CLI-095对大肠杆菌黏附绵羊乳腺成纤维细胞的影响。分离获得绵羊乳腺成纤维细胞,MTT测定结果显示,细胞活力良好;大肠杆菌以最适MOI=4∶1感染绵羊乳腺成纤维细胞后,各时间段LDH释放量均显著升高;caspase-3 mRNA的相对表达量在感染1～3 h内显著上升,3 h后表达量显著下降;caspase-4,5酶活性在感染1～3 h内升高,3 h后降低。TLR4的m...     

绵羊卵母细胞体外培养Ghrelin mRNA的表达

为揭示Ghrelin在绵羊卵母细胞的表达情况,运用实时定量RT-PCR技术检测不同培养系统中绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的相对表达量。结果表明,以M199和血清为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞GhrelinmRNA相对表达量均显著上升,仅以M199为基础培养基添加不同激素后培养的卵母细胞Ghrelin mRNA相对表达量均显著下降。在不同基础培养基中添加不同激素后,E2较FSH和LH有促进Ghrelin mRNA相对表达量升高的趋势。绵羊卵母细胞Ghrelin mRNA的表达以及在不同培养系统动力学变化,提示了这一新型分子在卵母细胞成熟过程中受激素潜在的调控作用。     

香石竹离体组织培养特性的研究

本实验以香石竹当年生带腋芽的茎段为外植体,研究它的诱导分化、继代增殖、生根培养各阶段离体培养的特性.结果表明:附加1.5mg/LBA和0.1 mg/LNAA的MS培养基适合腋芽的萌发诱导,诱导率达100%;附加0.5mg/LBA和0.1 mg/L NAA的培养基适合香石竹的增殖,增殖率达340%;附加1.0mg/L NAA的培养基为适宜的生根培养基.     

红花文殊兰的离体培养及快速繁殖

以红花文殊兰的鳞茎为外植体,研究不同培养基对其腋芽启动、不定芽增殖及生根培养的影响。研究表明,腋芽启动的最适培养基为5.0 mg/L MS+6-BA+0.2 mg/L NAA+活性炭1 g/L,腋芽的诱导萌发率为88%;不定芽增殖的最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+活性炭0.5 g/L,40 d的增殖系数可达7.16;壮苗培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+10%椰子水(CW)+活性炭0.5 g/L;生根的最适培养基为MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+活性炭0.5 g/L,生根率达100%,根系发达,植株生长健壮。生根苗经一段时间炼苗后,移栽到基质为树皮∶椰糠∶河砂=1∶1∶1的苗钵上,红花文殊兰的假植成活率达95%。该研究建立了红花文殊兰的快繁体系,为其工厂化生产提供技术支持。     

国内外8个不同种源地莲(Nelumbo)的成熟胚离体培养比较

建立高效获取无菌莲胚外植体的消毒体系,了解不同种源地莲的离体培养生长差异,为今后构建莲的优良离体培养及遗传转化体系提供可靠的材料和评估方法。使用不同浓度植物保护混合剂(plant preservative mixture,PPM)预培养法确定适宜的莲子消毒体系和无菌莲胚获取方式;在此基础上获得国内外9个种源地莲的成熟胚离体培养幼苗,通过观测其在不同培养时期的形态指标,利用隶属函数法综合评价其离体条件下的生长差异。研究发现,莲子比较理想的消毒体系为75%酒精消毒30 s + 2% PPM消毒2 h + 0.05% PPM浸泡催芽3~5天。其中,8个参试种源地莲的离体生长差异主要体现在培养后期,表现在展开叶数、茎节长度和粗度、根数及侧芽数等指标上。在相同培养条件下,越南莲和泰国莲的生长势最好、繁殖率较高。使用PPM浸泡成熟莲子进行预培养以获取无菌莲胚的方式,克服了以往莲子消毒不理想的技术难题。热带、亚热带分布的越南莲和泰国莲的离体无性系生长势强,是构建莲再生体系和遗传转化体系的良好原材料。     

辣椒细胞质雄性不育系离体培养植株再生研究

以辣椒细胞质雄性不育系9704A和8214A为试材，取无菌苗真叶进行培养。研究了不同浓度的IAA,6-BA和GA3对不定芽的诱导和伸长作用，结果表明：MS+6-BA5.0 mg/L +IAA1.0 mg/L有利于不定芽的诱导。MB+IAA1.0 mg/ L +6-BA3.0 mg/L + GA32.0 mg/L +AgNO310.0 mg/L有利于芽的伸长。将2.0 cm以上的芽转入生根培养基诱导不定根发现：1/2Ms+IAA0.3~0.5 mg/L有利于不定根的诱导。     

葱兰的离体培养及再生体系研究

为了快速获得健康的葱兰幼苗,通过优化离体培养条件,建立葱兰高效的离体再生体系。利用葱兰叶片、鳞叶和顶芽作为外植体进行了愈伤组织和植株再生体系研究。结果表明,顶芽为最适外植体;丛生芽诱导和增殖的最适培养基为MS+TDZ 0.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L,其次是MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA 0.1 mg/L;生根培养基为1/2MS+ IBA 0.5 mg/L,生根率为100%,为葱兰的工厂化生产提供技术参考。     

In Vitro Culture of Hybrid Indica Rice Combined with Mutagenesis

The mutagenic effects of gamma radiation and sodium azide (SA) immersion of explants on culturability and frequency of somaclonal variation in indica rice were investigated. The results showed that young inflorescence and mature embryo were satisfactory explants both for in vitro culture and for mutagenesis. 1 kR gamma rays applied to immature embryos and exposure of calli derived from mature seeds at the dose range of 250—500 R led to a higher rate of callusing and plantlet regeneration, 0.5—1 kR would be the appropriate exposure for young inflorescence to produce a better culture response and higher variability, and 2.5—5.0 kR the optimal dose range for mature embryos. Immersion of mature seed in 2—4 mM sodium azide solution is a concentration level to induce these effects in indica rice. Application of optimal gamma exposure and chemical mutagen to rice explants enhanced the somaclonal variation frequency and provided a large number of variants useful for rice breeding.     

LED在植物组织培养中的应用

光是植物生长中的重要环境因子之一。LED因体积小、质量轻、寿命长、光强可调等优点,使其成为植物光环境调控的重要工具之一,并在节能和促进植物生长方面都具有明显的优势。目前,LED在植物组织培养研究中已得到广泛应用,并取得了一些宝贵的成果。本文介绍了LED的主要特点及其在植物组织培养中的应用情况。     

樱桃不同杂种优系的组织培养与快速繁殖

以樱桃的优良杂种优系F8、F10（Prunus.avium L.×Prunus . pseudocerasus L.）以及H8、H10（Prunus. cerasus L ×Prunus.pseudocerasus L.）为材料,MS和F14为基本培养基,通过添加不同浓度的6-苄基氨基腺嘌呤(6-BA)、 3-吲哚丁酸(IBA) 、赤霉素（GA3）进行杂种樱桃组织培养和快速繁殖技术的研究。结果表明：F14+6-BA （0.3～0.5）mg/L+GA30.1(单位下同)适合各个杂种优系初代培养诱导出植株,F14+6-BA （0.5～1.0）+IBA （0.1～0.3）+GA30.1能够很好的促进各个杂种优系分化不定芽,1/2MS+IBA0.5（或NAA 0.8）是各个杂种优系的最佳生根培养基。