美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GP4蛋白中和活性单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备具有中和活性的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究利用PRRSVSD53株的超离病毒作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠并进行细胞融合。采用PRRSVSD53株和真核表达的PRRSV各结构蛋白作为检测抗原,应用间接免疫荧光试验(IFA)筛选到一株稳定分泌抗SD53株GP4蛋白的杂交瘤细胞株(LM26)。抗体亚类鉴定其为IgG2a,轻链为κ链。原核表达一系列截短的GP4蛋白鉴定LM26的抗原表位结果显示,LM26识别的抗原表位序列为57VVLQDI^62,此抗原表位在美洲型PRRSV中相对保守。病毒中和试验结果显示,MAb LM26仅针对PRRSV SD53株具有中和活性,中和效价最高为1∶50,对其它美洲株PRRSV均不具有中和活性。该MAb的制备为进一步研究PRRSVGP4蛋白的结构和功能奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建及动物免疫试验

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株.PCR克隆除去信号肽序列的PRRSV ORF5基因,将其插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-ORF5.将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(缺失Asd、Cya、Crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF5).鉴定重组菌GP5蛋白的表达;测定重组菌定居特性及安全性;检测免疫小鼠血清抗体;流式细胞仪检测重组菌对小鼠T淋巴细胞CD4+和CD8+亚群的影响;最后进行免疫猪血清抗体检测.结果表明,酶切鉴定证实重组质粒构建成功;Western blot证实重组菌表达的GP5蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合;重组菌在体内可较稳定地定居于小鼠的肠系膜淋巴结和脾脏中,并在其中表达出GP5蛋白;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用;重组菌口服免疫小鼠可以产生抗GP5蛋白抗体且抗体具有中和活性;重组菌株能不同程度地使CD4+、CD4+/CD8+升高,而使CD8+下降,表明重组菌对细胞免疫功能具有调节作用;淋巴细胞增殖试验表明,重组菌能诱发小鼠产生较强的细胞免疫应答;重组菌口服免疫猪可以产生抗GP5蛋白抗体.本试验成功构建了能稳定表达PRRSV GP5蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,为研究PRRSV口服基因工程疫苗奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大.GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体.因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因.近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析

为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计,构建了GP5/M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的GP5/M融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,免疫家兔,对获得的兔抗GP5/M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示,成功构建10个GP5/M表达载体,10个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-GP5/M重组蛋白质;通过免疫家兔,检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明,试验成功建立了稳定获得GP5/M重组蛋白质的方法,初步鉴定了重组蛋白的免疫效力,为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析

为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较。结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332) 的核苷酸序列同源性分别为88.8%、99.5%、88.7%、88.7%和83.5%。系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型。以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据, 同时为研制基因工程疫苗奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒乌鲁木齐分离株GP5基因遗传变异分析

为对乌鲁木齐市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传变异情况进行研究与分析,应用RT-PCR方法对疑似感染PRRSV猪的组织脏器进行PRRSV GP5基因的扩增,将阳性样品PCR产物进行克隆和测序,并应用分子生物学软件对测序结果进行比对和遗传进化分析。结果显示,5株病毒分离株GP5基因全长均为603 bp,与JXA1株亲缘关系较近,同属于美洲株的同一基因亚群。本试验结果为掌握乌鲁木齐市PRRSV的分子遗传变异情况提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在酿酒酵母中的定位研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞（命名为3E10）,经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示：该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SDZP P126株GP2基因序列分析及其对病毒增殖的影响

旨在研究1株连续传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) SDZP P126 GP2基因的变异情况,以及GP2对病毒增殖的影响。构建GP2基因全长真核载体pEGFP-N1-GP2,利用生物学软件对GP2基因进行核苷酸和氨基酸的同源性分析,并将重组质粒pEGFP-N1-GP2转染到Marc-145细胞上,接毒后检测对病毒增殖的影响。通过GP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析,发现9个碱基的突变,这9个碱基的突变导致了5个氨基酸的突变。其中氨基酸序列中的第10位由亮氨酸突变为苯丙氨酸,这一突变在多株致弱毒株中存在,在Marc-145细胞转染重组质粒pEGFP-N1-GP2对病毒的增殖无显著影响。初步推断SDZP P126 GP2基因的突变对病毒在Marc-145细胞上增殖没有影响。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒SDZP P126株GP2基因序列分析及其对病毒增殖的影响

旨在研究1株连续传代的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) SDZP P126 GP2基因的变异情况,以及GP2对病毒增殖的影响。构建GP2基因全长真核载体pEGFP-N1-GP2,利用生物学软件对GP2基因进行核苷酸和氨基酸的同源性分析,并将重组质粒pEGFP-N1-GP2转染到Marc-145细胞上,接毒后检测对病毒增殖的影响。通过GP2基因核苷酸和氨基酸的同源性分析,发现9个碱基的突变,这9个碱基的突变导致了5个氨基酸的突变。其中氨基酸序列中的第10位由亮氨酸突变为苯丙氨酸,这一突变在多株致弱毒株中存在,在Marc-145细胞转染重组质粒pEGFP-N1-GP2对病毒的增殖无显著影响。初步推断SDZP P126 GP2基因的突变对病毒在Marc-145细胞上增殖没有影响。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白翻译起始位点的研究

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N蛋白)的表达是通过非连续性转录合成的亚基因组(Subgenomic,sg)mRNA翻译而来。但位于亚基因组前导序列中的2个AUG均不能作为N蛋白翻译的起始位点,其翻译使用的是N开放阅读框(ORF)中的首个AUG,因此,本研究旨在感染性克隆的基础上研究N蛋白的翻译起始位点。作者实验室已有在ORF6和ORF7之间插入酶切位点的感染性克隆pORF673,该突变克隆中含有3个潜在的AUG,分别构建了pORF673中N蛋白的其中2个潜在的起始密码子AUG突变的全长克隆,转染Marc-145细胞。这些突变体都能够拯救出子代病毒,其中2个突变病毒的N蛋白的前11个氨基酸完全改变,这些突变病毒都能够在Marc-145细胞上稳定传代。经RT-PCR分析子代病毒的N基因序列及其亚基因组序列,结果表明N蛋白的翻译偏向于使用其ORF的第1个潜在的AUG。如果后者移码,则病毒可以自身修复,这是首次发现病毒有矫正ORF的功能。本研究为N蛋白N端插入标签作为标记疫苗以及进一步研究N蛋白结构与功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合病毒结构蛋白2b研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状并导致高死亡率的传染病,近年来国内外学者对病原进行了更广泛深入的研究。2b蛋白是新发现的小结构蛋白,分子质量约10 ku,能够诱导产生中和抗体,是ORF2的优势蛋白,研究发现其是一种病毒离子通道蛋白,与病毒感染过程有关,它可以促使PRRSV粒子脱壳,释放RNA到宿主细胞内,但对病毒的装配不起作用,论文就该蛋白的结构和功能进行了综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病,主要引起母猪繁殖障碍,表现为妊娠后期流产、死胎、木乃伊胎及弱仔。E蛋白是由ORF2b编码的一个非糖基化结构蛋白,分子质量约10 ku,具有影响病毒复制的作用,促使病毒粒子脱壳,但对病毒的装配不起作用,认为具有离子通道蛋白活性。作者就E蛋白的特性、亚细胞定位和拓扑结构、离子通道活性作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,该病毒自发现以来受到国内外学者的高度重视,对病毒结构蛋白的研究也正在逐步深入和完善.论文综述了近年来PRRSV结构蛋白的最新研究进展,特别对新发现的5a蛋白的结构与功能、决定病毒入侵的细胞受体及与其结合的病毒囊膜蛋白等问题进行深入分析,从而...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学分析

为研究中国猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的基因变异情况,对GenBank中公布的中国不同时间和地区分离的53株PRRSV毒株的N、GP5基因序列分别进行了遗传变异分析。根据N基因构建的遗传进化树分析表明,所有的中国大陆分离株均属于美洲型（NA）,中国的PRRSV分离株可分为4个亚群,亚群1中的毒株主要分布在中国东南部地区,其GP5主要中和抗原表位基因高度变异;亚群2主要为以CH1a株为代表的毒株;亚群3中的毒株与疫苗株MLV和VR2332高度一致;而台湾地区的分离株与大陆地区的分离株差异较大,单独归属于亚群4。这些研究结果对了解中国流行的PRRSV毒株的分子流行病学具有重要意义,也可部分解释MLV或灭活的CH1a疫苗对亚群1病毒感染猪保护力较低的原因,为今后制定PRRS的防控措施提供科学依据。