烟草抗马铃薯Y病毒(PVY)病突变体筛选与鉴定

[目的]筛选与鉴定烟草抗PVY病突变体,为寻找抗PVY的基因奠定基础.[方法]通过苗期对烟草突变材料进行PVY接种鉴定,肉眼对材料进行初步筛选,对筛选到的抗性材料进一步荧光定量鉴定,对筛选鉴定的抗性材料进行苗期鉴定及田间抗性鉴定.[结果]2011年筛选获得2个高抗PVY的突变体MZE2-15和MZE2-16,以及3个耐PVY突变体MZE2-70、MZE2-207及MZE2-228;2012年进一步筛选鉴定,突变体材料MZE2-407和MZE2-428感PVY,MZE2-16和2份MZE2-15突变体材料抗PVY.[结论]试验结果为控制烟草PVY病的危害提供了理论依据.     

烟草苗期抗CMV生理生化研究

以晋太18号、铁把子、新农3-1号、NC89、云烟85等7个烟草品种为试材研究苗期人工接种CMV病情指数和成株期网室内人工接种及自然发病病情指数之间的相关性,随后选出抗病性不同的3个品种在苗期进行烟草与CMV互作中烟草体内生理生化机制的初步研究。结果表明:苗期人工接种病情指数和成株期病情指数呈正相关,利用苗期人工接种可以作为快速鉴定和筛选抗CMV优良材料的辅助手段。超氧化物歧化酶(SOD)活性变化率在接种后前期(1～5d)为抗病品种高于感病品种(铁把子>新农3-1号>NC89),过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化率在平均水平上也表现如此。因此,接种后SOD、POD、PAL活性变化率可以作为烟草抗性鉴定的辅助指标。     

筛选烟草抗黑胫病细胞突变体的粗毒素浓度的初步研究

烟草黑胫病严重影响烟草的生产,是一类毁灭性真菌病害.近年来,随着无公害烟叶概念的提出,降低农药残留,减少农药使用,提高烟叶品质,成为烟叶生产所追求的目标.因此,防治烟草黑胫病的研究重点应该放在强抗病性烟草品种的选育上.采用细胞突变体筛选与组织培养技术相结合的方法,以烟草黑胫病无菌粗毒素对两个烟草品种(红花大金元、云烟8...     

黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定

【目的】白粉病是危害黄瓜产量、品质的最严重的病害之一,抗白粉病材料的发掘与研究,可以实现从根本上解决病害问题。对获得的‘长春密刺’突变体材料进行分析,旨在筛选出黄瓜抗白粉病突变体材料,丰富育种群体。【方法】对400份‘长春密刺’突变体材料进行苗期接种白粉病菌试验,通过叶片病斑观察结合病情指数分析,初步筛选出抗病材料,将筛选出的抗病材料在大田环境下自然发病进一步观察表型。对初步筛选出的抗病材料进行苗期生理鉴定,测定并分析超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、可溶性蛋白含量等生理指标,通过田间自然发病进一步筛选抗病材料,并测定其蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度、净光合速率等光合作用指标及乙烯、茉莉酸、水杨酸激素含量,并通过荧光定量PCR分析叶片中乙烯、茉莉酸、水杨酸、木质素、病程相关蛋白等防御信号途径中相关基因的表达。【结果】与感病材料相比,抗病材料的表面菌斑少,净光合速率、气孔导度都优于对照‘长春密刺’,胞间CO2浓度低于‘长春密刺’。在防御激素方面,抗病材料的乙烯、茉莉酸、水杨酸含量同样优于感病材料,而在成熟期叶片的防御信号途径相关基因表达上...     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体I抗毒素愈伤组织的有效筛选

以６０Ｃｏ－γ射线照射烟草优质感病品种的花药作为诱变手段,用烟草黑胫病疫霉菌粗毒素为筛选剂,对烟草花粉植株叶片的愈伤组织,进行抗病突变体细胞的筛选．试验表明：毒素对烟草愈伤组织的存活和增殖有明显的抑制作用,抑制程度随毒素浓度提高而加强,同一浓度对不同品种也存在着差异．综合毒素浓度对烟草愈伤组织抑制、增殖程度及筛选的有效性,初步认为：筛选红大和Ｋ３２６抗黑胫病突变体细胞的最适粗毒素浓度分别为３０％和４５％．所筛选出的抗病突变体细胞,其细胞水平的抗性与再生植株的抗病性鉴定相吻合．     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体Ⅰ抗毒素愈伤组织的有效筛选

 以⁶⁰Co-γ射线照射烟草优质感病品种的花药作为诱变手段,用烟草黑胫病疫霉菌粗毒素为筛选剂,对烟草花粉植株叶片的愈伤组织,进行抗病突变体细胞的筛选.试验表明:毒素对烟草愈伤组织的存活和增殖有明显的抑制作用,抑制程度随毒素浓度提高而加强,同一浓度对不同品种也存在着差异.综合毒素浓度对烟草愈伤组织抑制、增殖程度及筛选的有效性,初步认为:筛选红大和K326抗黑胫病突变体细胞的最适粗毒素浓度分别为30%和45%.所筛选出的抗病突变体细胞,其细胞水平的抗性与再生植株的抗病性鉴定相吻合.     

在试管中筛选烟草抗黑胫病突变体

用烟草体细胞愈伤组织与烟草黑胫病菌共同培养,在209块G_(140)烟草体细胞愈伤组织中有1块长出抗菌突变系,离开选择压力后经3次140天继代培养仍能表达抗性。用烟草黑胫病菌接种在单倍体试管苗上,从546株八大香单倍体试管苗中筛选到1株(代号RB_1)、从2431株小黄金1025单倍体试管苗中筛选到2株(代号RS_(1.3))抗病突变系。初步鉴定RB_1、RS_(1.3)、的抗病性均超过其亲本和高抗品种G_(140);取RB_1、RS_(1.3)叶片培养,其体细胞无性系植株群体仍具抗病性。     

植物提取物抗烟草花叶病毒活性的筛选

对24种常见植物的乙醇提取物进行体外抑制烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）的活性测定,结果表明抑制率达75%以上的植物有10种,对其中抑制作用较好的两种植物的乙醇提取物采用不同极性溶剂进行萃取初分并对各萃取物的抗TMV活性进行测定。采用叶盘法对植物提取物抑制TMV增殖效果进行测定,结果表明其中3种植物提取物对TMV的增殖有较好的抑制作用。     

粳稻抗稻瘟病细胞突变体筛选技术体系的建立

选取较感病主栽品种“辽粳454”作为研究材料,以稻瘟病病菌粗毒素为选择压,进行抗稻瘟病细胞突变体筛选,以期获得优良粳稻品种的抗病系。试验结果表明:经粗毒素处理后,对粳稻种的胚根、胚芽、愈伤组织成活率及愈伤组织分化率都有一定的抑制作用。但愈伤组织在生植株的抗性显著提高。     

烟草抗赤星病突变体ces2-1的产生和鉴定

用烟草花叶病毒弱毒株系N14预先接种,可以诱导烟草对病原真菌赤星病菌的系统获得性抗性(SAR),减轻病菌引起的赤星病.选择表现诱导抗性最强植株材料进行组织培养与植株再生,通过体细胞无性系变异增强和巩固SAR性状,获得SAR组成性表达的突变体(constitutive expresser of SAR)ces2-1.除了抗病表型,ces2-1还组成性表达多种防卫反应基因.回交实验与遗传分析表明,ces2-1是在野生型位点上的单基因显性突变.对ces2-1与野生型进行mRNA差异显示分析,得到一个ces2-1独有、在野生型中缺少的转录本,与前人报道的烟草受过氧化氢诱导的一个基因片段同源.用cDNA末端快速扩增技术克隆了这个转录本的全长序列,根据生物信息学分析与功能的初步测定,把这个基因命名为烟草受过氧化氢诱导的抗病相关基因(hydrogen peroxide-induced 1,NtHPI1).     

贵州省五烟区烟草CMV、PVY带毒率检测

采用间接酶联免疫吸附分析法对贵州省5个主要烟草种植区的田间烟草进行了黄瓜花叶病毒病和马铃薯Y病毒病的检测,并采用一步RT-PCR法验证试验的准确性.结果表明:思南、凤冈、德江、正安和清镇5个烟区烟草的CMV带毒率分别为66％、67％、54％、59％和40％,PVY带毒率分别为54％、56％、37％、49％和36％,复合侵染率分别为32％、23％、27％、23％和7％.     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体 Ⅱ 抗毒素愈伤组织的再生植株及其后代的抗病性鉴定

 用黑胫病粗毒素作为选择压力,结合辐射诱变技术,从烟草花粉植株叶片的愈伤组织中筛选出抗毒素的愈伤组织,并对其再生植株及其M₂代进行抗病性鉴定、选育。目前已获得6个高抗黑胫病的细胞突变株系,且抗病性状表现稳定,并建立了一套烤烟抗黑胫病突变体的筛选和鉴定体系。研究结果表明,在细胞水平上筛选抗病突变体是开发新抗源的有效途径。     

运用致病毒素筛选抗烟草黑胫病细胞突变体Ⅱ 抗毒素愈伤组织的再生植株及其后代的抗病性鉴定

用黑胫病粗毒素作为选择压力, 结合辐射诱变技术, 从烟草花粉植株叶片的愈伤组织中筛选出抗毒素的愈伤组织, 并对其再生植株及其 Ｍ２ 代进行抗病性鉴定、选育． 目前已获得６ 个高抗黑胫病的细胞突变株系, 且抗病性状表现稳定, 并建立了一套烤烟抗黑胫病突变体的筛选和鉴定体系． 研究结果表明, 在细胞水平上筛选抗病突变体是开发新抗源的有效途径．     

利用电转化法构建烟草野火病菌的Tn 5插入突变体

采用电转化法将含有kanr基因标记的EZ::Tn 5转座子插入到烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci)的基因组中.结果表明,在电压为2 400 V条件下,供试的烟草野火病菌菌株SMX 006及WT 4的电转化效率分别为0.8×103,4.2×103 cfu·μg-1 DNA.转化电压下降至1 800 V时,WT 4菌株的转化效率也随之下降至1.64×103 cfu·μg-1 DNA.对转化子进行kanr筛选以及特异性PCR鉴定,表明Tn 5可以稳定地插入到受体菌的基因组中.对烟草野火病菌SMX 006的Tn 5插入突变体进行了多次致病性﹑运动性和胞外蛋白酶活性测定,从中获得了2个致病力明显减弱的突变株(H 028,H 029)、1个运动能力明显减弱的突变株(H 028)、1个运动能力丧失的突变株(H 029)、1个产胞外蛋白酶能力明显减弱的突变株(H 046),以及1个胞外蛋白酶缺失的突变株(H 045).     

烟草抗赤星病突变体ces21的产生和鉴定*

 用烟草花叶病毒弱毒株系N14预先接种,可以诱导烟草对病原真菌赤星病菌的系统获得性抗性（SAR）,减轻病菌引起的赤星病。选择表现诱导抗性最强植株材料进行组织培养与植株再生,通过体细胞无性系变异增强和巩固SAR性状,获得SAR组成性表达的突变体（constitutive expresser of SAR）ces2-1。除了抗病表型,ces2-1还组成性表达多种防卫反应基因。回交实验与遗传分析表明,ces 2-1是在野生型位点上的单基因显性突变。对ces 2-1与野生型进行mRNA差异显示分析,得到一个 ces 2-1独有、在野生型中缺少的转录本,与前人报道的烟草受过氧化氢诱导的一个基因片段同源。用cDNA末端快速扩增技术克隆了这个转录本的全长序列,根据生物信息学分析与功能的初步测定,把这个基因命名为烟草受过氧化氢诱导的抗病相关基因（hydrogen peroxide induced 1,NtHPI1）。     

抗烟草花叶病毒活性放线菌的初步筛选和鉴定

为筛选对烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)具有拮抗活性的放线菌,以烤烟Coker 176、K326为材料,采用生物活性测试和半叶枯斑法,测定47株放线菌菌株发酵上清液抗TMV的活性,对具活性的菌株进行分子鉴定和系统发育分析。结果表明,6株放线菌的发酵上清液具有一定的抗TMV活性,其中菌株F187、F349、F417发酵上清液对TMV具有明显钝化作用,发酵上清液与TMV作用30 min后抑制率分别为57.18%、60.27%、70.19%;分子鉴定和系统发育分析显示菌株F187、F417、F349均属链霉菌;链霉菌F187、F349、F417的代谢产物对TMV有较高的抑制活性,值得在菌种鉴定、发酵条件优化、活性物质的分离与鉴定等方面进行深入研究。