桃果实生长素结合蛋白ABP1的克隆及表达分析

ABP1是一种能够快速响应生长素信号的结合蛋白,参与细胞伸长、质膜极化、网格蛋白内吞及果实发育等生理过程。以‘24号’桃果实为试验材料,应用荧光实时定量PCR分析PpABP1在桃果实发育过程中的表达量变化,以及外施NAA对桃果实PpABP1表达量的影响。结果表明:PpABP1在桃果实中果皮和种子不同发育时期均有表达,花后52dPpABP1表达量均达到最大值;外施NAA对桃果实发育过程中PpABP1表达量的影响与发育时期相关,在桃果实硬核期,外施NAA会降低PpABP1在中果皮的表达。本试验初步证实桃果实发育过程中存在由ABP1介导的信号转导途径,PpABP1在桃果实中的表达存在发育特异性。     

桃果实生长素结合蛋白ABP1的克隆及表达分析

ABP1是一种能够快速响应生长素信号的结合蛋白,参与细胞伸长、质膜极化、网格蛋白内吞及果实发育等生理过程。以‘24号’桃果实为试验材料,应用荧光实时定量PCR分析PpABP1在桃果实发育过程中的表达量变化,以及外施NAA对桃果实PpABP1表达量的影响。结果表明:PpABP1在桃果实中果皮和种子不同发育时期均有表达,花后52dPpABP1表达量均达到最大值;外施NAA对桃果实发育过程中PpABP1表达量的影响与发育时期相关,在桃果实硬核期,外施NAA会降低PpABP1在中果皮的表达。本试验初步证实桃果实发育过程中存在由ABP1介导的信号转导途径,PpABP1在桃果实中的表达存在发育特异性。     

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。     

桃果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆与表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素合成酶(PSY)基因的全长核苷酸序列,命名为PpPSY。PpPSY全长1 532 bp,编码区长度627 bp,共编码翻译成208个氨基酸。进化树分析发现,PpPSY与梅果实PmPSY亲缘性较高。蛋白质序列分析表明,PpPSY包含底物结合位点、Mg²⁺结合位点、活性位点残基盖、催化残基、天冬氨酸富集区等功能结构域,其属于isoprenoid biosynthesis enzymes class 1超级家族。实时荧光定量PCR结果显示,PpPSY基因在黄肉品种金丽发育组织中的表达高于白肉品种湖景,且在金丽品种中,PpPSY基因在花苞和硬核果中的表达显著高于在花、叶芽和软核果中的表达。本实验桃果实PpPSY基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

桃果实PpARF1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】为了探讨转录因子ARF1(Auxin Response Factor)对桃果实发育调控的机制。【方法】以‘24号’桃果实为试验材料,构建桃ARF1基因的原核表达载体pET32a-PpARF1,转化到BL21(DE3)中诱导表达菌体蛋白,筛选出重组蛋白的最适表达条件,按照最适条件大量摇菌诱导表达蛋白,并进行重组蛋白的纯化,最后用纯化诱导后的重组蛋白制备多克隆抗体及WB检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测得到pET32a-PpARF1重组蛋白的位置大约在95.0kD,在37℃,转速250r/min,IPTG 0.10mmol/L,诱导4h,诱导出的蛋白表达量最大。免疫印迹试验显示所得抗血清能很好检测到目的蛋白。【结论】ARF转录因子参与生长素调控桃果实发育成熟的过程。     

桃果实番茄红素β-环化酶基因的克隆及表达分析

以黄肉品种桃果实‘金丽’为试验材料,利用同源序列克隆技术获得桃果实番茄红素β-环化酶(LCYb)基因的全长核苷酸序列,命名为PpLCYb。PpLCYb全长1 699bp,编码区长度1 515bp,编码504个氨基酸。进化树分析发现PpLCYb与草莓FaLCYb亲缘性较高。氨基酸序列分析表明PpLCYb含有特征序列LYAMPF及NAD(P)/FAD结合区,属于SDR超级家族。实时荧光定量PCR结果显示PpLCYb基因在桃果实中的表达总体呈现上升的趋势,并在果实处于硬熟期时达到较大值,随后在完熟期略有下降。桃果实PpLCYb基因的克隆及表达分析可为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机制奠定良好的基础。     

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(PpZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考.[方法]从黄肉品种桃果实中克隆PpZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况.[结果]克隆获得的PpZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸.PpZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGA-GLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域.PpZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小.整个桃果实成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的PpZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中PpZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05).[结论]PpZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用.     

植物生长素结合蛋白ABP1的研究进展

ABP1(Auxin Binding Protein)是最早发现的生长素结合蛋白之一,作为一种生长素受体参与质膜上生长素的响应过程,在细胞周期、细胞扩增、质膜内吞作用和基于ROP的细胞骨架重建等快速反应中起着重要的作用。因此,对ABP1最新的研究进展进行了综述,以期为生长素受体作用机制的深度阐明提供参考。     

桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH结合区蛋白的原核表达、纯化及复性

为了剖析桃果实中脱落酸受体ABAR/CHLH蛋白的结合活性,从桃果实中提取总RNA,采用RT-PCR方法,以桃果实RNA逆转录的cDNA为模板,扩增出ABAR/CHLH基因的结合区功能片段C369,回收目的片段并测序,基因片段长度为1 121 bp,编码369个氨基酸残基,分子量约为40 kD。利用BamHⅠ和NotI酶切位点将该片段编码区插入原核表达载体pET-28a（＋）中,构建ABAR/CHLH基因片段原核表达载体pET28a-C369,经菌落PCR和测序确证后,转化E.coliRosetta（DE3）,通过IPTG诱导其表达His-CHLH融合蛋白。通过SDS-PAGE检测及Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化目的蛋白,并用纯化复性的His-CHLH C369融合蛋白制备抗体。     

生长素结合蛋白ABP1研究进展

就生长素结合蛋白在植物体内的分布、结构和性质、亚细胞定位及其受体功能的研究概况作了简要介绍。     

桃单果重与6个物候期性状的遗传关联分析

【目的】关联分析作为传统连锁分析方法的有效补充,可以鉴定果树的数量性状位点（Quantitative Trait Loci, QTLs）。本研究通过关联分析定位桃单果重及6个物候期性状的QTLs,以研究性状间的遗传相关,为提高桃品质育种的效率奠定理论基础。【方法】以来源于中国6个生态群的104份桃地方品种为试材,利用分布于桃8条连锁群上的53对SSR（Simple Sequence Repeats）引物,用STRUCTURE 2.3.3和TASSEL 2.0.1软件分别对群体结构和全基因组SSR位点间的连锁不平衡（Linkage Disequilibrium, LD）状况进行分析。在结合单果重和6个物候期性状表型数据后进行关联分析,以定位各性状的QTLs。【结果】群体结构显示供试的104份桃地方品种基于数学模型可以分为5群;LD分析表明在53个SSR位点组成的1378个成对组合中,23个成对位点存在着显著LD且得到统计概率支持。虽然相关性分析表明单果重只与展叶期显著相关,但关联分析却显示单果重不仅与盛花期、展叶期、果实成熟期和落叶期均具有相同的关联位点;而且桃单果重的关联位点与不同连锁群上盛花期、果实发育期和落叶期的关联位点也存在显著的LD现象。对单果重具有最大增效表型效应的等位变异UDP96-013-206同时具有提前花期1.46 d、延迟果实成熟期13.77 d、延迟落叶期2.17 d的表型效应。【结论】本研究得到27个与桃单果重及6个物候期性状关联的QTLs,部分位点与前人定位的连锁群相同。关联分析表明单果重与盛花期、展叶期、果实成熟期、果实发育期和落叶期确实存在遗传相关,主要表现为这几个性状可能受到基因多效性调控或者受连锁群内及连锁群间存在连锁或关联关系的基因调控。     

桃(Prunus persica L.)茎尖培养技术的研究

筛选出了适合于桃品种‘北农早艳’茎尖(0.2 mm 和0.5 mm)培养的培养基为:G培养基附加 IBA 0.25 mg/L+BA 0.5 mg/L+GA_3 1.0 mg/L+LH 500.0 mg/L。茎尖用聚氨酯海绵作支撑物的液体培养比琼脂培养成活率高2～5倍,且生长迅速。获得了0.2 mm 长茎尖的生根植株。     

桃SERK2 的克隆及其在不同状态愈伤组织中的表达分析

【目的】 分离克隆桃（Prunus persica L.）体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinases,SERKs）基因SERK2 ,检测其在不同状态桃愈伤组织中的表达差异,分析SERK2 与胚性愈伤组织发生的关系,为揭示组织培养困难树种桃胚性愈伤组织产生的分子机理奠定基础。【方法】 采用同源克隆法获得PpSERK2 的cDNA全长序列,运用TMPred、DNAMAN和MEGA 5.0等生物信息学软件对序列进行分析;以‘秋蜜红’花药为外植体,接种至添加2.0 mg·L ^-1 6-BA和1.0 mg·L ^-1 2,4-D的NN69培养基诱导愈伤组织;将获得的不同状态愈伤组织制作石蜡切片并进行组织细胞学观察;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对PpSERK2 在4种不同状态愈伤组织中的表达进行分析。 【结果】 克隆获得‘秋蜜红’PpSERK2 的cDNA全长序列1 881 bp,编码626个氨基酸,其蛋白质理论分子量为68.99 kD,理论等电点为5.38,具有完整的SERK蛋白的保守结构域,与牡丹（Paeonia suffruticosa ）等物种的同源性为67.88%—92.71%,且与秘鲁番茄（Solanum peruvianu ）和温州蜜柑（Citrus unshiu ）的相似性最高。在与其他物种的SERK蛋白构建的系统进化树中,PpSERK2与SpSERK1、CitSERK1和PsSERK2等聚在一起,与同源性比对结果一致。以‘秋蜜红’花药为外植体诱导获得4种不同状态的愈伤组织,组织细胞学观察发现黄色疏松状（球形胚出现）、绿色紧实状（心形胚出现）和浅黄色透明状（尚未完全形成的鱼雷形胚结构出现）的3种状态的愈伤组织细胞小、排列紧密;而黄白色水渍状愈伤组织细胞体积大、排列不规则,细胞质稀且染色浅。根据形态学和组织学的鉴定结果,可知黄色疏松状、绿色紧实状和浅黄色透明状的3种状态的愈伤组织均为胚性愈伤组织,而黄白色水渍状愈伤组织为非胚性愈伤组织。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明,PpSERK2 在‘秋蜜红’3种状态的胚性愈伤组织中的表达量显著高于非胚性愈伤组织,且在3种胚性愈伤组织中的表达量有差异,其中在黄色疏松状愈伤组织中表达量最高,绿色紧实状次之,浅黄色透明状中最低。【结论】 克隆获得PpSERK2 的cDNA全长序列,其在3种状态的胚性愈伤组织中的表达量明显高于非胚性愈伤组织,且在黄色疏松状胚性愈伤组织中的表达量最高,PpSERK2 在桃体细胞胚发育的早期发挥作用。     

雨花2号桃离体微繁殖技术研究

以桃品种雨花2号春季嫩梢茎段为外植体,通过外植体消毒方法的筛选,以及腋芽诱导、腋芽增殖和生根培养基的筛选,以建立该品种的快繁体系,并解决桃离体快繁过程中常见的玻璃化和黄化问题.研究结果表明:最佳的外植体消毒方法为先以75.00%酒精浸润20 s,再用0.10% HgCl2 0.01%吐温对外植体表面消毒8 min;LP 6-BA 0.80 mg/L IBA 0.30 mg/L最利于腋芽萌发;LP 6-BA 1.50 mg/L IBA 0.20 mg/L的继代增殖培养基上4周芽增殖倍数达3.5～4.0,且植株健壮;适宜生根培养基为MS IAA 1.50 mg/L.同时,研究发现,在继代培养基中添加0.20 mg/L GA3可使黄化苗转绿,培养基中Ca2 浓度增加至0.729 mmol/L可以有效地抑制和消除玻璃化现象,培养基中使用6.50 g/L琼脂粉也可抑制玻璃化苗的产生.     

‘鲁星’桃中10个MADS-box基因克隆和表达分析

【目的】克隆‘鲁星’桃(Prunus persica var.nectarina‘Luxing’)中参与调控营养和生殖生长的MADS-box(Pp MADS)基因,研究其在不同组织器官中的表达特性,为解析该基因在花发育和果实发育及成熟过程中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得‘鲁星’桃中10个Pp MADS全长c DNA序列,并进行生物信息学相关分析;采用RT-PCR技术检测PpMADSs在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣等组织以及花发育7个阶段和果实发育5个阶段的表达特性。【结果】测序结果显示,获得10个PpMADSs(Pp MADS11、12、19、20、21、22、28、29、30和31;Gen Bank登录号分别为KU559577、KU559578、KU559585、KU559586、KU559587、KU559588、KU559594、KU559595、KU559596和KU559597),其开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为522、279、1 065、828、723、600、636、534、750和480 bp。进化分析表明,PpMADS11属于AP3亚组,PpMADS12是AGL17亚组,Pp MADS19属于MIKC*组,Pp MADS20、21和22同被分为Mα组,PpMADS28、29、30和31同属于Mγ组。亚细胞定位预测结果显示,10个PpMADS蛋白均定位于细胞核中。启动子分析显示,PpMADSs启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、防御及逆境响应元件、干旱诱导的MYB结合位点、热激响应元件、低温响应元件、真菌效应子响应元件、伤害响应元件、厌氧响应元件、GA响应元件、Auxin响应元件、Me JA响应元件、ABA响应元件、SA响应元件和乙烯响应元件。半定量RT-PCR和q RT-PCR结果显示,PpMADS11在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣、花发育和果实发育中表达;PpMADS12在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花发育中表达;Pp MADS19在萼片、雄蕊、花瓣和花发育中(苗期除外)表达;Mα组和Mγ组所有成员在茎、叶、萼片、子房、雄蕊、花瓣和花发育中均有表达,部分成员在果实发育中表达。【结论】10个PpMADS在‘鲁星’桃的营养生长以及花和果实发育过程中可能具有重要的调控作用。     

不同类型桃果实内酯芳香物质构成与重要性评价

【目的】分析不同类型成熟桃果实的内酯芳香物质构成,并评价其对于桃果实芳香的重要性。【方法】以涵盖不同果肉质地、果肉颜色、果实成熟期等的多品种桃果实为试材,采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用体系检测样品的芳香物质,通过精确的定性和定量分析,明确内酯芳香物质的构成,并结合芳香物质的气味活性值分析评价其重要性。【结果】内酯芳香物质存在于本研究全部桃品种的成熟果实中,样品中共检测到10种内酯芳香物质,包括γ-己内酯、γ-辛内酯、γ-庚内酯、γ-癸内酯、5-羟基-2, 4-癸二烯酸-δ-内酯、δ-癸内酯、γ-十一内酯、δ-辛内酯、茉莉内酯、顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯。各内酯物质具有特定的气味属性,主要散发果香（桃/椰子）、甜香、奶油香、焦糖香、花香和草本味等气味。不同品种的桃果实共有的内酯物质是γ-己内酯,较为普遍存在的内酯物质包括γ-癸内酯和δ-癸内酯,部分品种存在特有的内酯物质,如‘深州蜜桃’果实中的顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯。果实成熟期时,溶质‘白花水蜜’‘深州蜜桃’‘橙香’‘奉化玉露（晚）’‘肥城红里大桃’等品种中检测到较多种类的内酯芳香物质,硬质‘霞脆’‘秦王’‘华玉’等品种果实具有较少种类的内酯芳香物质。气味活性值分析表明,由于极低的气味阈值和较高的物质含量,γ-癸内酯存在于大部分品种中,且对于这些品种桃香气的形成具有重要贡献,使溶质‘深州蜜桃’‘橙香’‘奉化玉露（晚）’‘白花水蜜’等品种果实均具有较为强烈的典型的桃香气味,溶质‘阿初桃’和硬质‘华玉’品种的典型桃果芳香较淡,而未检测到该内酯的硬质‘秦王’‘霞脆’品种果实则没有典型的桃果芳香。此外,γ-辛内酯使部分品种（本研究中为‘橙香’和‘深州蜜桃’）桃果实呈现更为强烈的椰果味和非常甜的气味。【结论】内酯是桃果实挥发性芳香物质的一个重要类别,桃果实内酯物质构成丰富,成熟果实至少包含10种内酯芳香物质。内酯物质类别和含量的差异是不同品种尤其是不同果肉质地的桃果实芳香特征的一个重要体现,而不同果肉颜色或成熟期品种的内酯芳香无显著差异。γ-己内酯是品种之间共有的内酯物质,γ-癸内酯和δ-癸内酯是品种之间较为普遍存在的内酯,顺式-4-羟基-6-十二烯酸内酯等是部分品种特有的内酯物质。γ-癸内酯和γ-辛内酯等内酯对于品种的典型桃香气以及独特芳香气味的形成具有重要贡献。     

桃分子遗传图谱构建及红肉性状基因定位概述

红肉桃果肉颜色鲜艳,富含酚类物质和花色苷,抗氧化能力强,营养与保健价值高,成为目前研究热点之一。利用先进的分子标记技术辅助育种是加快红肉桃育种进程的重要手段,而构建高密度的遗传连锁图谱是红肉桃性状快速、定向改良的前提。对近年来国内外桃分子遗传图谱构建及红肉性状基因定位的研究进展进行了综述,并对今后的研究方向提出了建议,旨在为红肉桃品质改良和分子育种提供参考依据。