拟黑多刺蚁5-HT2A受体基因cDNA的克隆及表达

【目的】克隆拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)5-HT2A受体基因的cDNA序列,并对其核苷酸序列和系统进化进行分析,检测其在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫和不同品级成虫mRNA的表达情况,为探究5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁生长发育的调控规律提供证据。【方法】从拟黑多刺蚁中提取总RNA,RT-PCR扩增并克隆Pv5-HT2A受体基因;用ProtParam预测蛋白质序列,Blast比较蛋白质序列同源性,用Clustal X进行核酸和氨基酸序列比对,MEGA 6.0比邻法生成系统进化树。利用荧光实时定量PCR检测Pv5-HT2A受体基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫及不同品级成虫mRNA的表达水平。【结果】克隆得到Pv5-HT2A受体基因的cDNA序列,全长2 965bp,开放阅读框长1 926bp,编码641个氨基酸。疏水性分析显示,Pv5-HT2A受体氨基酸具有7个跨膜疏水区,属于典型的G蛋白偶联受体类型。系统发育分析表明,拟黑多刺蚁与红收获蚁的亲缘关系最近,相似度达69%。荧光实时定量PCR结果显示,拟黑多刺蚁5-HT2A mRNA在不同发育阶段和不同品级成虫中均有表达,其中卵、3龄幼虫及蛹期的表达量较高;成虫中,雄蚁表达量最高,雌蚁的表达量最低。【结论】拟黑多刺蚁与其他昆虫的5-HT2A受体基因存在相关性,推测5-HT2A受体基因对拟黑多刺蚁的生长发育具有一定调节作用。     

昆虫5-羟色胺受体的研究进展

对5-羟色胺及其受体进行介绍,并阐述了昆虫5-羟色胺受体结构和功能以及5-HT受体的信号转导机制的国内外研究现状及其发展动态。最后,分析基于5-羟色胺受体分子靶标的新药剂的研发现状。     

家蚕糖转运蛋白BmST5基因的克隆与转录活性检测

根据GenBank已登陆的糖转运蛋白序列与家蚕基因组框架图和EST序列,获得家蚕同源糖转运蛋白基因BmST5。基因编码区长1 527 bp,编码508个氨基酸,预测蛋白分子质量为55.67 kD。序列分析结果显示,该基因有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与体虱等同源蛋白的一致性在50%以上。RT-PCR结果表明,该基因仅在家蚕的马氏管、生殖腺和头中有表达,在中肠、丝腺、血液、体壁和脂肪体中不表达。     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇（Drosophila melanogaster）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（AAN09371）氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列．家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶（bmga pdh）基因长1485 bp（NO：DQ202316）,包括5′UTR 221 bp,3′UTR 265 bp和完整的999 bp ORF框,编码333个氨基酸残基．用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91％,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71％．bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包含3个外显子．3′UTR序列包含AATAA终止信号和Poly（A）．推导的氨基酸序列N端包含与NAD^＋结合的保守结构域：ASCTTNCL．     

家蚕ga Pdh基因的克隆及分析

从家蚕EST数据中检索到果蝇(Drosophila melanogaster)甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(AAN09371)氨基酸同源序列,用seqMAN延伸,电子克隆家蚕gapdh的cds,用PCR克隆家蚕gapdh基因序列.家蚕甘油醛-3-磷酸脱氢酶(bmgapdh)基因长1 485 bp(N0:DQ202316),包括5'UTR 221 bp,3'UTR 265 bp和完整的999 bpORF框,编码333个氨基酸残基.用BLASTN进行同源性分析表明与果蝇的同源性为91%,与鹌鹑胚胎纤维细胞序列同源性最差,为71%.bmgapdh基因在家蚕基因组中是单拷贝的,包舍3个外显子.3'UTR序列包含AATAA终止信号和Poly(A).推导的氨基酸序列N端包含与NAD+结合的保守结构域:ASCTTNCL.     

家蚕凋亡相关基因ice的克隆及在大肠杆菌中的表达

ICE(白细胞介素-1β转换酶)是caspase家族 (半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶cys-teinylaspartate specific proteinase)中最早发现的成员,在多细胞生物细胞凋亡的过程中起着重要作用.为了深入了解模式昆虫家蚕ICE在凋亡通路中的作用,采用紫外线刺激家蚕细胞,PCR克隆获得2个新的ice基因不同剪切体,分别命名为ice-2和ice-5(GenBank登录号:DQ360829和DQ360830),并将这2个剪切体分别克隆进原核表达载体pET28a中,在大肠杆菌中诱导表达,对表达产物进行了检测,结果显示ICE-2和ICE-5蛋白表达过程中能发生自我剪切.     

5-羟色胺4受体mRNA在仔猪不同组织的表达

5-羟色胺4受体（5-HT4R）属于G-蛋白偶联受体超家族,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,调节多种神经递质的生理学效应.实验采用半定量RT-PCR的方法,检测和分析了猪5-HHTR的b亚型（5-HT4bR）基因mRNA在11种组织中的表达规律.结果发现,猪5-HT4bR在除肝脏以外的10种组织中都有表达,且不同组织内的表达量存在差异,其中脑组织和肠组织表达量较高.这一结果与5-HT4R基因在人和鼠上不同组织表达规律一致.     

鹅催乳素受体基因cDNA 5'端序列克隆

为寻找鹅就巢性相关基因,从洪泽湖性成熟公鹅睾丸组织分离并合成鹅cDNA第一链;利用RACE克隆了鹅催乳素受体基因(gPRLR)5'端序列.所克隆的499 bp 5'端序列可划分为348 bp 的5'-UTR、151 bp的以ATG作为起始密码子的阅读开放框.与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA序列作比对,此499 bp序列可划分为238 bp 的第1外显子、69 bp 的第2外显子、114 bp 的第3外显子及81 bp 的部分第4外显子,起始密码子位于第3外显子45 bp处.阅读开放框核苷酸序列与cPRLR cDNA同源部位的阅读开放框同源性达到88%,推导的氨基酸序列同源性达到84%.     

鹅催乳素受体基因cDNA5′端序列克隆

为寻找鹅就巢性相关基因,从洪泽湖性成熟公鹅睾丸组织分离并合成鹅cDNA第一链;利用RACE克隆了鹅催乳素受体基因(gPRLR)5′端序列。所克隆的499 bp 5′端序列可划分为348 bp的5′-UTR、151 bp的以ATG作为起始密码子的阅读开放框。与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA序列作比对,此499 bp序列可划分为238 bp的第1外显子、69 bp的第2外显子、114 bp的第3外显子及81 bp的部分第4外显子,起始密码子位于第3外显子45 bp处。阅读开放框核苷酸序列与cPRLR cDNA同源部位的阅读开放框同源性达到88%,推导的氨基酸序列同源性达到84%。     

家蚕生物钟基因Bmtim2的克隆与序列分析

[目的]为进一步研究家蚕生物钟基因的功能提供依据。[方法]从家蚕品种p50未受精卵提取总RNA,利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆家蚕生物钟基因Bmtim2cDNA序列。最后运用实时定量RT-PCR对该基因在家蚕不同发育时期的表达情况进行初步分析。[结果]利用RACE扩增,获得长度为1867bp、包括完整3'非翻译区的家蚕生物钟基因timeless2(Bmtim2)cDNA序列。经推导,获得该基因序列编码的584个氨基酸残基的蛋白质序列。该蛋白序列具有TIM蛋白的C末端保守区,与黑腹果蝇、尖音库蚊的TIM2基因具有近缘进化关系。Bmtim2基因在家蚕生活周期各时点均有表达。[结论]该结果对研究Bmtim2基因在家蚕发育过程的时空表达差异及其与日周节律的关系具有参考价值。     

Cloning and Expression Profile of Deoxyhypusine Snyhtase Gene and Deoxyhypusine Hydroxylase Gene in Silkworm, Bombyx mori

Deoxyhypusine snyhtase （DHS） and deoxyhypusine hydroxylase （DOHH） are the two enzymes that catalyze the synthesis of hypusine within eukaryotic initiation factor 5A （eIF5A）. Synthesis of hypusine is essential for the function of eIF5A in eukaryotic cell proliferation and survival. Here we described the cloning and expression of two full-length cDNAs, encoding respectively DHS-like protein and DOHH-like protein from Bombyx mori by using the methods of bioinformatics, RACE, and RT-PCR technology, named as BmDHS and BmDOHH. Sequencing results indicate that they are 1 311 and 1 874 bp in length including complete open reading frame （ORF） 1 116 and 915 bp, which encode 371 amino acids （molecular weight is about 41.11 kD and isoelectric point is 5.84） and 304 amino acids （molecular weight is about 34.30 kD and isoelectric point is 4.86）, respectively. BmDHS contains only 1 exon, and BmDOHH contains 4 exons and 3 introns. The deduced amino acid sequence of BmDHS contains a deoxyhypusine synthase domain from 47 to 361 amino acid residues, and the deduced amino acid sequence of BmDOHH contains 6 E-Z type HEAT repeat domains （23-52, 54-83, 87-116, 177-206, 208-237, and 241- 270）. Compared to DHS and DOHH amino acid sequences from other species, such as Homo sapiens and Drosophila melanogaster, both silkworm DHS protein and DOHH protein have more than 55% identity. The conservative regions are very similar with each other. The phylogenetic tree analysis indicated that not only DHS but also DOHH from different species has genus-specific features. The expressions of BmDHS and BmDOHH are no tissue and stage specific in our tested samples.     

家蚕溶茧酶基因的克隆、序列分析及原核表达

【目的】获得家蚕溶茧酶基因的全长序列,实现溶茧酶基因在大肠杆菌中的融合表达。【方法】利用cDNA末端扩增技术（RLM-RACE）克隆了家蚕溶茧酶基因cDNA序列（GenBank 登录号：EF428980）。【结果】家蚕溶茧酶基因cDNA序列全长1 047 bp,其中780 bp的蛋白质编码区可编码260个氨基酸,预测蛋白质分子量为27.6 kD,等电点（pI）为8.89。家蚕溶茧酶基因包含4个内含子。用Signal P 3.0 Server程序分析家蚕溶茧酶基因,预测其从第1～22位为信号肽序列。SMART分析结果预测其第34～254位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶活性。重组质粒pET-32a-Cocoonase 转化E.coli BL21进行原核表达,SDS-PAGE分析结果表明,家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达,相对分子量为48 kD。【结论】本研究成功地克隆、表达了家蚕溶茧酶基因,分析和预测了它的结构和功能,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

家蚕JAK/STAT信号通路相关基因克隆与分析

【目的】鉴定家蚕JAK/STAT信号通路组成原件,并预测家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因的功能。【方法】在电子克隆的基础上,通过RT-PCR获得家蚕JAK/STAT信号通路的主要相关基因;利用在线软件对相关蛋白进行结构域分析;基于microarray数据库或qPCR分析各基因的组织表达特征。【结果】克隆了家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因,包括BmSTAT、BmHOP、BmSOCS2、BmSOCS5A、BmSOCS5B、BmSOCS6、BmDRK、Bmken、BmPIAS1、BmPIAS2以及BmPI3K,但没有能克隆到果蝇Upd1、Upd2和Upd3的同源体基因。序列分析显示BmHOP具CRD_FZ、Kringle、转膜区域和PKc超家族蛋白激酶催化结构域TyrKc;BmSTAT有2种亚型,均具SH2、STAT_bind、STAT_int和STAT_alpha结构域;在克隆的BmSOCS家族的3个基因中,BmSOCS2A和BmSOCS6A具典型的SH2和SOCS结构域;BmDRK由SH3和SH2两种结构域形成了SH3-SH2-SH3串联结构;BmKen存在BTB和锌指结构域,BmPIAS1和BmPIAS2具有LCR结构域,BmPI3K具有2个SH2结构域。【结论】成功克隆了家蚕JAK/STAT信号通路主要相关基因。相关蛋白的保守结构域分析显示,在家蚕JAK/STAT信号通路中,BmHOP是JAK激酶的一种,可以磷酸化BmSTAT转录因子,激活靶基因转录;BmSOCS、Bmken、BmPIAS1以及BmPIAS2对JAK/STAT通路起负反馈作用。     

RNA干涉家蚕细胞Ago蛋白家族基因的表达研究

分别构建RNAi(RNA interference,RNAi)载体干扰家蚕细胞BmN中Argonaute1(Ago1)和Argonaute2(Ago2)基因的表达。首先利用PFBDM和pBac[A3-EGFPafm]载体构建Ago1和Ago2基因的RNA干涉载体,通过转染家蚕细胞发现,Ago1和Ago2基因表达明显下降。并观察细胞形态发现,转染RNAi载体96h后,家蚕BmN细胞逐渐失去正常的梭形状态,体积变大,形态变圆。该研究为进一步研究家蚕中small RNA的产生及作用机制提供了较好的基础。     

家蚕感染二分浓核病毒(镇江株)的数字基因表达谱分析

【目的】筛选家蚕与二分浓核病毒(Bombyx mori bidensovirus Zhenjiang strain,Bm BDV-ZJ)感染相关的差异表达基因,鉴定家蚕与病毒感染有关的调控基因,为进一步阐明家蚕抗Bm BDV-ZJ的分子机制提供理论依据。【方法】采用Illumina高通量测序技术,构建家蚕品种JS口服感染Bm BDV-ZJ的数字基因表达谱,为排除个体间差异,以10头蚕作为一个样本用于DGE检测。样本中基因的差异表达检测通过严格的运算法则进行,对差异检验的P值(P value)作多重假设检验校正,通过控制FDR(false discovery rate)来决定P值的域值。本研究中,差异表达基因定义为FDR≤0.001且差异倍数在2倍及以上(|log2ratio|≥1)的基因。采用基因本体论(GO)分类体系确定所有差异表达基因可能的功能。用GO计算P值和bonferoni校正。选用校正P值≤0.05作为基因组显著富集的阈值。WEGO软件用来视化、比较和绘制GO注释结果。利用KEGG数据库进行通路富集分析,进一步确定显著富集代谢途径或信号传导途径,Q值≤0.05的通路指定为DGEs中的显著富集通路。通过q RT-PCR方法对部分差异表达基因进行验证。【结果】感染组和对照组分别得到4 850 663和4 875 307个原始标签,去除低质量标签后,分别得到4 757 934和4 788 406个清洁标签,对应的标签种类数量分别为62 436和63 680种。两个文库间的清洁标签和清洁标签种类的数量在不同拷贝区间分布类似,感染组和对照组样本的测序量分别为3.5 M和3.7 M,测序深度符合试验的要求,两样本的DGE数据是可信的。将这两个DGE数据库的所有清洁标签与家蚕参考基因库进行比对,在对照组与感染组中,分别有36.39%和45.30%的清洁标签可以比对到基因。另有50.02%和43.34%的清洁标签可以比对到家蚕参考基因组,剩余的未知标签分别占清洁标签总数的13.59%和12.35%。共发现了447个差异表达基因,其中306个上调表达,141个下调表达。分别有218、147和179个差异表达基因涉及GO 3个本体中的分子功能、细胞组分和生物过程。利用KEGG公共数据库进行Pathway显著性富集分析,注释到的基因总数为8 473个。447个差异表达基因经鉴定后,其中的330个基因被归类到151个KEGG路径中。差异表达基因显著富集的Pathway(Q值≤0.05)有19个,其中最显著富集的是细胞质中DNA识别通路。挑选了24个差异表达基因进行q RT-PCR验证,其中20个基因的差异表达趋势与DGE的结果一致。其中在DNA识别通路中共检测到9个差异表达基因,BGIBMGA009408-TA、BGIBMGA004913-TA、BGIBMGA011753-TA均为编码RNA聚合酶III的基因,表达量均上调,是对照组的4.3、2.3、3.4倍。【结论】构建了3龄家蚕JS感染Bm BDV-ZJ后28 h感染组及对照组幼虫的数字基因表达谱,Pathway显著性富集分析和q RT-PCR验证显示,家蚕感染Bm BDV-ZJ后可能通过启动胞质内DNA识别通路来感应入侵病毒的异源DNA成分并迅速启动天然免疫抵御Bm BDV-ZJ病毒感染,为研究Bm BDV-ZJ侵染家蚕和家蚕抵御Bm BDV感染的分子机制打下了基础。     

家蚕sirtuin家族基因的鉴定及系统发生与表达芯片分析

【目的】鉴于sirtuin家族基因重要而多样性的功能,从家蚕全基因组中鉴定sirtuin家族基因,并进行基因结构、蛋白结构及其理化性质、基因进化、组织表达芯片分析及在不同组织中的定量表达情况分析,为研究家蚕sirtuin家族基因的功能和推动家蚕模式生物系统化的研究奠定基础。【方法】基于家蚕基因组数据库,通过生物信息学手段,利用比较基因组学方法,鉴定家蚕sirtuin家族成员;开放阅读框（ORF）的预测用ORFfinder进行;使用SIM4进行ORF的内含子和外显子的预测;用GSDS和ExPaSy在线工具分别进行基因结构图和蛋白序列理化性质的预测;用CLUSTAL_X软件进行多序列联配及对其二级结构进行分析,并用ESpript进行二级结构作图;使用SMART在线软件进行蛋白功能域预测;MEGA5.0软件用于系统发生树分析;利用已有的家蚕幼虫5龄第3天的芯片数据进行组织表达分析;利用荧光定量PCR技术检测家蚕sirtuin家族基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达情况。【结果】系统分析鉴定了家蚕中存在的5个sirtuin家族基因（Bmsirt2、Bmsirt4、Bmsirt5、Bmsirt6、Bmsirt7）,共分为4类（I、II、III、IV）。5个基因分布在家蚕5条染色体上,均为单拷贝基因。基因结构分析显示5个基因均为多外显子基因。同源比对和系统进化分析发现家蚕的sirtuin家族基因与类群中其他昆虫的同源基因形成明显的直系同源关系且高度同源,同样不含有sirt3。蛋白结构预测发现家蚕的sirt6与其他物种的sirt6蛋白一样含有两个sir2结构域聚在一起。组织表达芯片分析发现,sirtuin家族基因在多个组织中具有转录活性。荧光定量PCR检测结果显示家蚕的Bmsirt4在脂肪体、丝腺中低表达;Bmsirt5在精巢、中肠中高量表达,在脂肪体、血液、丝腺中低量表达,与芯片数据基本一致。【结论】通过全基因组分析,家蚕共有5个sirtuin家族成员,进化上分为4类,且与其他昆虫高度同源,芯片数据和实时荧光定量 PCR 结果基本一致,分析表明组织表达模式具有多样性。     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

家蚕核型多角体病毒ORF 75基因的克隆及表达

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyxmori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其连接至pMD18-T载体上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列.利用设计的酶切位点将目的基因从克隆载体上切下.表达质粒pGEX-4T-2经BamHI/XhoI双酶切,与目的片断连接,得到重组表达质粒pGEX/Bm75.将重组表达质粒pGEX/Bm75转化入大肠杆菌BL 21中,经IPTG诱导表达后,12%SDS-PAGE分析表明产生57 kDa左右的特异蛋白质条带.对表达产物进行Westernblotting分析,结果表明,pGEX/Bm75经IPTG诱导产生的57 kDa蛋白条带与抗体发生了很强的交叉反应,融合蛋白得到了表达.     

家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征

【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。