进境哈萨克斯坦油葵中向日葵黑茎病菌的检疫鉴定

依据出入境检验检疫行业标准SN/T 3174-2012,对新疆口岸进境的哈萨克斯坦油葵中的向日葵黑茎病菌进行检疫鉴定。挑取油葵样品中的可疑病种子和植株残体作为实验材料,分别提取其DNA,用向日葵黑茎病菌特异性检测引物LEPB/LEPF对挑取的样品进行PCR检测初筛,初筛结果阳性者,进行病原分离培养。对分离获得的阳性纯培养菌株的菌落、孢子形态进行观察,PCR检测及致病性测定,最终确定其为向日葵黑茎病菌。本研究从进境哈萨克斯坦油葵中分离到检疫性病原菌,新疆周边口岸应进一步加强疫情监测与调查。     

法国向日葵种子中向日葵黑茎病菌的首次截获与检测

从法国进境向日葵种子中分离到3株疑似向日葵黑茎病的菌株,对所有菌株进行形态学、致病性测定和分子序列比对分析。分离菌菌落乳白色或象牙色至灰白色,有大量黑褐色分生孢子器产生,分生孢子器球形至扁球形,内含无色单胞、卵圆形分生孢子,有明显或不明显油球;针刺接种4片真叶向日葵幼苗的下胚轴,7～9d后茎部产生典型黑茎病黑色椭圆形病斑,病斑上着生黑色分生孢子器;菌丝DNA用ActF1/R1和ITS1/ITS4扩增,序列与NCBI基因库中P.macdonaldii序列相似性为98%～100%。形态学、分子生物学及致病性检测结果显示,截获的3株菌均为向日葵黑茎病菌。     

进境日本杜鹃中杜鹃花枯萎病菌的检疫鉴定

 自宁波口岸进境日本杜鹃花种苗上,采用常规平板分离法获得1株疑似杜鹃花枯萎病菌的菌株OV5。该菌株可在马铃薯葡萄糖琼脂和玉米粉琼脂培养基上生长,但在麦芽汁培养基上不生长。经培养可产生少量气生菌丝和大量小型分生孢子,小型分生孢子球状,直径 3.0 ~ 3.5 μm,在纺锤体状菌丝的尖端产生,易脱落,有时呈短链状。菌核卵圆形或饼形,明显杯状,凹面光滑,(1.5 ~ 6) mm × (2 ~ 8)mm × (0.5 ~ 1.5) mm,成熟时黑色。经rDNA ITS基因序列比对分析,发现该菌株与来源于CBS的2株杜鹃花枯萎病菌标准菌株的ITS基因序列同源性达99%以上,位于同一个发育分支。致病性测定结果表明,该菌株可侵染杜鹃花,引起典型杜鹃花枯萎病菌症状。上述研究结果表明,所截获病菌为杜鹃花枯萎病菌,这是我国首次截获该种检疫性真菌。     

进境高粱种子中葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

从进境的美国高粱样品中分离到一株与葡萄茎枯病菌Didymella glomerata相似的菌株4358-17。其菌落形态和显微特征均与葡萄茎枯病菌一致。多个位点(LSU、ITS、TUB2、ACT)序列比对显示菌株4358-17与GenBank登录号为KT389718、FJ427004、FJ427115、FJ426896的葡萄茎枯病菌相似性均达到100%。系统发育分析结果表明菌株4358-17与葡萄茎枯病菌株聚集在同一个分支上,支持率为99%。菌株4358-17接种高粱和小麦叶片,4d后接种部位出现明显症状。根据上述试验结果,将进境美国高粱样品中分离的菌株4358-17鉴定为葡萄茎枯病菌。     

不同引物PCR检测向日葵黑茎病菌的灵敏度比较及应用

为准确快速筛查进境油葵种子中携带的向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii,采用常规PCR方法比较了3对向日葵黑茎病菌PCR检测引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR的灵敏度,对哈萨克斯坦进境120批油葵种子样品进行PCR检测,并对检测为阳性的样品进行产物序列测定及病原菌分离。结果显示,引物320FOR/320RVE的检测灵敏度最高,可达10-5ng/μL,引物LEPB/LEPF和LLF/LLR分别为10-4ng/μL和10-3ng/μL。利用引物320FOR/320RVE、LEPB/LEPF和LLF/LLR对120批进境油葵种子样品进行检测,阳性检出率分别为65%、50%和45%,阳性检出率高低与引物的检测灵敏度相一致。阳性样品扩增的产物序列与Gen Bank中向日葵黑茎病菌的序列同源性最高;分离的病原菌菌落为乳白色至灰白色,分生孢子器黑褐色、球形并产生透明状分生孢子液,分生孢子单胞、无色、肾型、两端有油球,与已报道的向日葵黑茎病菌的病原特征描述一致,初步鉴定哈萨克斯坦进境油葵种子中存在向日葵黑茎病菌。     

进境澳大利亚大麦夹杂油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定

采用常规平板分离法,从进境澳大利亚大麦中夹杂的油菜籽上获得1株疑似油菜茎基溃疡病菌的菌株01829.通过致病性测定、形态学观察、特异性引物扩增、ITS序列比对分析,对01829进行了种类鉴定.结果表明:菌株01829在PDA培养基上生长较慢,菌落边缘不整齐,产生大量分生孢子器和分生孢子;采用特异性引物对LMR1-D和L...     

进境油菜籽中黑胫病菌和茎基溃疡病菌的检测

为准确鉴定从进境澳大利亚油菜籽样品中分离的真菌分离物,利用形态学特征、PCR检测、序列分析以及致病性测试等方法对分离物6382-43和6382-51进行了鉴定试验。结果表明,分离物6382-43的形态特征和油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans相似,菌丝生长较慢,菌落边缘不规则,不产生色素。油菜茎基溃疡病菌特异性引物LmacF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜茎基溃疡病菌的序列相似性为99.8%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜茎基溃疡病的典型症状。分离物6382-51的形态特征和油菜黑胫病菌L.biglobosa相似,菌丝生长较快,菌落边缘规则,产生色素;油菜黑胫病菌特异性引物LbigF/LmacR检测为PCR阳性;ITS区序列和油菜黑胫病菌的序列相似性为100%;接种幼嫩油菜子叶产生油菜黑胫病的典型症状。根据分离物的形态特征、PCR检测结果、序列分析以及致病性测试结果,将进境澳大利亚油菜籽样品中的真菌分离物6382-43和6382-51分别鉴定为油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria maculans和油菜黑胫病菌L.biglobosa。     

进境澳大利亚大麦上葡萄茎枯病菌的检疫鉴定

自进境澳大利亚大麦样品上,采用常规平板分离法获得1株疑似葡萄茎枯病菌菌株74919。通过形态学特征观察、β-tubulin和actin序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株74919在PDA培养基上生长良好,可产生大量分生孢子器和厚垣孢子;基于β-tubulin和actin序列构建的系统发育树中,菌株74919和其他葡萄茎枯病菌相关序列划分在同一分支;菌株74919接种大麦叶片,在接种部位引起叶斑症状。根据上述实验结果,将菌株74919鉴定为葡萄茎枯病菌(Didymella glomerata),这是我国口岸首次从进境澳大利亚大麦中截获葡萄茎枯病菌。     

向日葵黑茎病菌TaqMan-MGB探针实时荧光快速检测方法

 向日葵黑茎病菌是我国进境检疫性有害生物名录中的一种检疫性真菌。根据向日葵黑茎病菌及其近似种的ITS序列差异,设计并合成特异性引物和探针,建立了向日葵黑茎病菌的实时荧光PCR检测方法。特异性试验结果表明,该检测方法能特异性检测向日葵黑茎病菌;灵敏度试验结果表明,最低检测限量为20 μL反应体系中总DNA含量0.1 pg;实时荧光PCR优化反应条件为引物终浓度0.6 μmol·L^-1,探针终浓度0.3 μmol·L^-1。实际样品检测结果表明,该方法可用于疑似携带向日葵黑茎病菌样品的检测与初筛。此方法快速、灵敏,整个反应过程约1 h,检测过程完全闭管,无需PCR后续处理,为早期快速检测向日葵黑茎病菌提供了重要参考。     

向日葵茎溃疡病菌RPA检测方法的建立

向日葵茎溃疡病菌(Diaporthe helianthi)是我国进境植物检疫性病原真菌.本研究针对D.helianthi的cal基因保守序列设计特异性引物,建立该病菌的重组酶聚合酶扩增检测技术(RPA)方法,并对其特异性、灵敏度及适用性进行评价.结果 显示,建立的RPA方法特异性强,只有3个D.helianthi样品能...     

进境美国大豆夹杂向日葵黑茎病菌的检疫鉴定

正大豆是一种重要的粮食作物和食用油原料,国内的市场需求量日益增长,目前我国已成为大豆净进口国。进口大豆虽能满足国内市场需求,但加大了外来有害生物传入的风险。向日葵黑茎病是一种毁灭性的向日葵病害,其病原菌向日葵黑茎病菌Plenodomus lindquistii属于我国进境检疫性植物病原真菌(段维军等,2015;2017)。2017年12月,宁波口岸自进境美国大豆夹杂的向日葵种子上分离获得1株菌株72298-10,为明确其分类地位,本研究通过形态学观察、ITS序列分析和致病性测定对其进行鉴定,以期为口岸疫情检测、防控和后续处理等工作提供参考。     

台湾省苹果上牛眼果腐病菌的截获鉴定

为明确从宁波空港口岸入境旅客携带苹果上截获的1株明孢盘菌属菌株60017的分类地位,通过形态学特征观察、内转录间隔区(ITS)和β-微管蛋白基因(β-tubulin)序列比对分析以及致病性测定,对该菌株进行了种类鉴定。结果表明:菌株60017在PDA培养基上的菌落为圆形,边缘整齐,呈乳白色,气生菌丝较少,可产生大量分生孢子;基于ITS和β-tubulin序列构建的系统发育树中,菌株60017和苹果牛眼果腐病菌Neofabraea kienholzii处于同一分支;菌株60017接种苹果后,在接种部位能引起褐腐症状,与原发病症状一致。结合形态学特征、致病性测定结果以及分子鉴定结果,最终将该菌株鉴定为苹果牛眼果腐病菌N. kienholzii。     

罗布麻锈病病原菌鉴定

2011—2014年新疆阿勒泰地区罗布麻Apocynum venetum种植田普遍发生锈病,为明确引起罗布麻锈病的病原菌,通过研究其致病性、形态学特征以及寄主范围,并结合r DNA-ITS和28S r DNA D1/D2区段的序列分析对病原菌进行了鉴定。结果表明,经形态学和分子生物学鉴定,引起罗布麻锈病的病原菌为罗布麻栅锈菌Melampsora apocyni,可侵染罗布麻叶片、枝条和果实,造成大量叶片枯黄凋落,病害严重时可导致植株死亡。罗布麻锈病5月中、下旬开始发病,7月下旬至8月中旬为发病高峰期,病害发生期可持续至罗布麻生长季结束,该病害引起的病田率、病株率和病叶率最高均可达100%。寄主范围测定表明,该病原菌不仅可侵染罗布麻,也可侵染白麻Poacynum pictum和大叶白麻P.hendersonii,且在白麻和大叶白麻上的发病率分别为83%和99%,均高于罗布麻,表明白麻可作为罗布麻栅锈菌的新寄主。     

楚雄腮扁叶蜂虫生真菌粉红粘帚霉的鉴定及其生物学特性

为明确楚雄腮扁叶蜂Cephalcia chuxiongica病原真菌的种类,以组织分离法对自然罹病死亡的楚雄腮扁叶蜂进行虫生真菌的分离培养,根据形态学特征和rDNA ITS序列分析对所得虫生真菌进行鉴定,并对其中的高毒力菌株进行生物学特性测定。结果表明:共分离得到4属25株菌株,其中以粉红粘帚霉Clonostachys rosea出现频率最高,共分离到15株,均与GenBank中粉红粘帚霉相关菌株亲缘关系最近,ITS序列同源性达100%,属优势种。按照柯赫法则证实4个属的虫生真菌对楚雄腮扁叶蜂均有致病力,其中粉红粘帚霉致病力最强,其高毒力菌株SWFUYHL 02-01对楚雄腮扁叶蜂幼虫致死中时为10 h;蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基最适宜该菌株生长和产孢,其次是马铃薯葡萄糖琼脂培养基;该菌的最适生长温度为25℃,光照对其菌丝生长无显著影响;在以不同种类糖为碳源的培养基上该菌株均能生长,以蔗糖为碳源的培养基上产孢量最高,显著高于以其它糖为碳源时;适宜其生长的氮源是酵母浸出粉,适宜产孢的氮源是硝酸铵和尿素,以硫酸铵和酵母浸出粉为氮源时不产孢;适宜菌丝生长和产孢的无机盐分别是MnSO_4和MgSO_4,添加CaCl_2的培养基上未见产孢;光照对粉红粘帚霉孢子萌发无显著影响。粉红粘帚霉菌株在采样点的出现频率与其生物学特性完全吻合。     

埃及吹绵蚧昆虫病原真菌的筛选、鉴定及其致病性测定

为明确埃及吹绵蚧Icerya aegyptiaca昆虫病原真菌在生物防治中的应用潜力,采用生物测定法筛选得到产孢量高和致病力强的优势分离株,根据形态学特征和rDNA ITS序列分析对优势分离株进行鉴定,并对其室内毒力和温室防效进行测定。结果显示,筛选得到的优势分离株为IJID003,产孢量最高,可达8.51×10~6个/mL,且致病力最强,处理埃及吹绵蚧2龄若虫5 d后,其校正死亡率为95.40%;根据形态学特征和r DNA ITS序列分析鉴定结果,确定该分离株为爪哇棒束孢Isaria javan‐ica。随着分离株IJID003接种浓度的增加,埃及吹绵蚧2龄若虫、3龄若虫和雌成虫的校正死亡率也随之增加,致死中时间LT50则递减;在分生孢子浓度为1.00×10~8个/mL时,其对2龄若虫、3龄若虫和雌成虫的LT50最小,分别为1.89、2.29、2.31 d;随着接种后天数的延长,致死中浓度LC50减小,在接种后6 d,其对2龄若虫、3龄若虫和雌成虫的LC50最小,分别为1.25×10~3、2.04×10~4、8.37×10~5个/mL,表明分离株IJID003对埃及吹绵蚧2龄若虫的毒力较其它2种虫态高;啶虫·毒死蜱2 000倍液对埃及吹绵蚧2龄若虫的前期致死速率较快,而分离株IJID003在后期侵染速率较快,处理后6 d两者的防效无显著差异,效果相当。表明爪哇棒束孢分离株IJID003具有产孢量高且致病力强的特点,在埃及吹绵蚧生物防治中具有较好的应用前景。     

进境苹果果实中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定

对来自美国的苹果进行了病原菌分离,结果在果实中分离到1株疑似苹果牛眼果腐病菌的菌株Nk-2968。对其进行了病原菌形态学观察、致病性测定并结合分子生物学方法检测,实验结果表明,菌株Nk-2968在PDA培养基上生长良好,能产生大量的分生孢子;经真菌通用引物(ITS4/ITS5)及β-tubulin引物(Bt-T2m-Up/Bt-LVL-Lo)分别扩增和测序,菌株Nk-2968与Gen Bank中登录号AF281462.1、HG793110.1和HG793112.1的菌株序列同源性达到100%;病菌接种苹果8 d后开始发病。根据上述实验结果,将分离获得的菌株Nk-2968鉴定为苹果牛眼果腐病菌(Neofabraea kienholzii)。这是我国口岸首次在进境的苹果果实上截获该危险性有害生物。     

口红吊兰菌核病病原鉴定及其生物学特性分析

为鉴定1株分离自口红吊兰叶部病斑上的疑似核盘菌菌株,利用柯赫氏法则验证其致病性并通过形态观察和ITS序列分析对该病原菌进行分类鉴定,结合温度、酸碱度等生理指标研究其生物学特性,并利用菌丝生长速率法测定了扑海因、多菌灵、苯醚甲环唑、腐霉利4种药剂对该病原菌的抑制作用。结果显示:在PDA平板上该病原菌菌丝为白色,均匀生长;约7 d后开始产生菌核,直径3~5 mm;菌核萌发后可产生1~3个子囊盘,内含8个大小为8.0~12.0μm×4.0~5.5μm的子囊孢子。该菌株ITS序列系统进化分析结果显示,其与核盘菌的同源性高达99%。综上所述,初步确定该菌株为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum。该病原菌在PDA培养基上的最适生长温度为20~25℃、最适生长p H为5~7。室内毒力测定发现供试4种药剂中扑海因对该病原菌菌丝生长有较好的抑制效果,且其EC_(50)最小,仅为0.62 mg/L,证明扑海因对核盘菌毒力最强。